外周血miR-150-5p、SOCS1 mRNA對類風濕關節炎“病”“證”診斷意義的初步探討＊

邱明亮，朱衛娜，莫麗莎，徐衛東，高 波

（1. 江西中醫藥大學 臨床醫學院 南昌 330006；2. 江西中醫藥大學附屬醫院風濕病科 南昌 330006；3. 江西中醫藥大學附屬醫院兒科 南昌 330006；4. 南京醫科大學附屬常州第二人民醫院風濕免疫科 常州 213003）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種在成人當中常見的以關節病變為主的系統性、炎癥性自身免疫性疾病，全球約有1%的人群受其累[1-2]。現代醫學對于本病的研究，雖取得了長足的進步，但仍有部分患者誤診或延后診斷，錯過了最佳治療窗。需不斷探討新的生物標志物，以更明確的診斷本病。我國醫學認為，本病是風寒濕邪客于關節，氣血痹阻，導致以小關節疼痛、腫脹、晨僵為特點的疾病，屬于“尪痹”“痹證”“歷節”等范疇。中醫藥治療本病，限于證候客觀化研究的不足，作為臨床治療核心理念的“辨證論治”，無法充分發揮其指導作用。尋找客觀化指標，以指導“病”“證”的診斷，成為了中醫藥治療本病研究的重中之重。

作為表觀遺傳學機制之一，miRNAs 是真核生物內源性基因編碼的、長度為18-25 堿基的單鏈非編碼RNA。既往研究表明，miRNA 在固有免疫、適應性免疫及炎性因子的信號轉導過程中起著重要的調節作用[3]。Chen Z 等[4]發現，間充質細胞來源的miRNA-150-5p 可通過靶向結合于基質金屬蛋白和血管內皮生長因子，減少類風濕成纖維樣滑膜細胞的遷移和侵襲，抑制微管的形成。細胞因子信號傳導抑制因子（SOCS）是細胞因子信號傳導的經典抑制劑，由至少8種成分組成，即SOCS1-7 和CIS。其中SOCS1 在免疫細胞的調節中發揮重要作用[5]。Egan 等[6]研究發現，在mBSA-和IL-1誘導的關節炎小鼠模型中，相對于野生型小鼠，SOCS1-/-小鼠更易產生急性關節炎。De Hooge 等[7]在酵母聚糖誘導的大鼠模型中，證明缺乏STAT1 的炎癥性滑膜中，SOCS1 的水平明顯下降。提示miRNA-150-5p、SOCS1 mRNA 可能參與了類風濕關節炎的發生發展過程。

Zhou H 等[8]報道，過表達的miR-150-5p 可顯著降低狼瘡性腎炎的近端腎小管和系膜細胞中SOCS1 的表達，提示miR-150-5p 通過下調SOCS1 來增加促纖維化分子，從而促進腎纖維化。這說明SOCS1與miR-150-5p 關系密切。RA 患者中，SOCS1 與miR-150-5p是否存在靶向結合關系，兩者是否可作為RA 診斷的生物標志物，值得深入探討。

本研究擬基于miR-150-5p及SOCS1 mRNA，初步探討兩者在類風濕關節炎患者中的表達以及對西醫疾病和中醫證型判斷的指導意義，以期為類風濕關節炎“病”“證”的診斷提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為自2018 年5 月至2018 年12 月，江西中醫藥大學附屬醫院風濕病科門診和住院部就診的57 例RA 患者，我院健康體檢中心的19 例健康對照者（health control，HC）。本研究已獲我院倫理委員會審議通過。

1.1.1 納入標準

納入標準：①符合2010 年ACR/EULAR 類風濕關節炎分類標準[9]；②年齡≥18 歲，且≤80 歲；（③受試者知情同意，并簽署了知情同意書。

1.1.2 排除標準

排除標準：①年齡>80 歲或<18 歲者；②晚期嚴重關節畸形、功能喪失的患者；③妊娠或哺乳期女性患者、精神病患者；④有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統等嚴重疾病者；⑤精神病患者。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標及方法

所有受試者均記錄年齡、性別，并測定血常規、肝功能、腎功能。同時，所有RA 患者均記錄患者發病年齡、病程、用藥史及合并疾病，且均采用qPCR 法進行miR-150-5p、SOCS1 mRNA 等測定，采用雙熒光素酶方法判斷兩者是否存在靶向結合關系。

（1）miR-150-5p測定

采集受試者外周血全血10 ml，EDTA-K2抗凝，取淋巴細胞分離液分離，加入2 ml Trizon（CW0580S，CWBIO），渦旋混勻；采用miRNA 提取試劑盒（CW0627S，CWBIO）提取總RNA；采用紫光光度計測定mRNA 濃度、純度；采用miRNA cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒（CW2141S，CWBIO）逆轉錄cDNA；應用miRNA qPCR Assay Kit（CW2142S，CWBIO），按照Ul?tra SYBR Mixture（CW0957M，CWBIO）操作流程進行PCR 擴增。以U6 為內參，檢測miR-150-5p 的表達水平。MiR-150-5p及U6引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。U6 上游引物：GCTTCGGCAGCA?CATATACTAAAAT；Hsa-mir-150-5p 上 游 引 物：TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG。每個標本均做3 個復孔，反應結束后作溶解曲線分析。熒光定量PCR 的結果以每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數C（T）表示，C（T）值越大，參與反應的起始模板量就越少，反之則越多。miRNA-150-5p 與U6相對表達量用2-ΔΔCT值表示[10]。

（2）SOCS1 mRNA測定

外周血預處理同前；采用RNA 提取試劑盒（CW0581M，CWBIO）提取總RNA；采用紫光光度計測定RNA 濃度、純度；采用HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（CW2569M，CWBIO）逆轉錄CDNA；按照Ultra?SYBR Mixture（CW0957M，CWBIO）操作流程進行PCR擴增。以GAPDH 為內參，檢測SOCS1 mRNA 的表達水平。SOCS1 及GAPDH 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。GAPDH 上游引物：GAAGGTCG?GAGTCAACGGAT；SOCS1 上游引物：CGCACTTCCG?CACATTC。每個標本均做3 個復孔，反應結束后作溶解曲線分析。熒光定量PCR 的結果以每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數C（T）表示，C（T）值越大，參與反應的起始模板量就越少，反之 則 越 多。SOCS1 與GAPDH 相 對 表 達 量 用2-ΔΔCT值表示[10]。

表1 一般資料比較

（3）雙熒光素酶報告基因檢測

充分裂解293T 細胞后，12000 g 離心2 分鐘，取上清；取100μL平衡至室溫的Luciferase substrate加入檢測管酶標板中，小心吸取20μL 細胞裂解上清至酶標板中，迅速混勻后迅速于酶標儀中檢測Firefly lucifer?ase 報告基因活性；在以上反應液中加入100 μL 新配置的Renilla 底物工作液，迅速混勻后立即于酶標儀中檢測Renilla luciferase 報告基因活性。在以Renilla 熒光素酶為內參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU 值除以Renilla 熒光素酶測定得到的RLU 值。根據得到的比值來比較不同樣本間目的報告基因的激活程度。

（4）其他實驗室指標測定

均在江西中醫藥大學附屬醫院檢驗科檢測。血常規采用血細胞分析儀（SYSMEX，XE-2100）檢測，肝功能、腎功能采用全自動生化分析儀（Roche，P 800）檢測。

1.2.2 中醫辨證分型

所有RA患者均參照國家中醫藥管理局2010年發布的《22 個專業95 個病種中醫診療方案》進行中醫辨證分型[11]。具體癥候包括：①風濕痹阻證：肢體關節疼痛、重著，或有腫脹，痛處游走不定，關節屈伸不利，舌質淡紅，苔白膩，脈濡或滑；②寒濕痹阻證：肢體關節冷痛，局部腫脹、屈伸不利，關節拘急，局部畏寒，得寒痛劇，得熱痛減，皮色不紅，舌胖，舌質淡暗，苔白膩或白滑，脈弦緩或沉緊；③濕熱痹阻證：關節腫痛，觸之灼熱或有熱感，口渴不欲飲，煩悶不安，或有發熱，舌質紅，苔黃膩，脈濡數或滑數；④痰瘀痹阻證：關節腫痛日久不消，晨僵，屈伸不利，關節周圍或有皮下結節，舌暗紫，苔白厚或厚膩，脈沉細澀或沉滑；⑤氣血兩虛證：關節肌肉酸痛無力，活動后加劇，或肢體麻木，筋惕肉瞤，肌肉萎縮，關節變形，少氣乏力，自汗，心悸，頭暈目眩，面黃少華，舌淡苔薄白，脈細弱；⑥肝腎不足證：關節肌肉疼痛，腫大或僵硬變形，屈伸不利，腰膝酸軟無力，關節發涼，畏寒喜暖，舌紅，苔白薄，脈沉弱。

1.2.3 統計學處理

數據分析采用統計軟件SPSS22.0 計量資料用均數土標準差(±s)表示，計數資料用構成比（%）表示；分類資料組間比較采用x2檢驗。計量資料兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗（方差不齊釆用秩和檢驗），組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）；ROC曲線分析miR-150-5p、SOCS1 mRNA 的診斷意義，其表達水平與中醫證型的相關性分析采用無序多分類Logistic分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

57例類風濕關節炎組與19例健康對照組受試者，在性別、血常規、肝腎功能等方面，無統計學差異（P>0.05），具有可比性。健康對照組患者類風濕關節炎患者，其病程為111.33 ± 18.72（月）。RA 入組時用藥方面：服用糖皮質激素者6例（10.53%），非甾體類抗炎藥28 例（49.12%），甲氨蝶呤33 例（57.89%），來氟米特19例（33.33%），雷公藤多甙10 例（17.54%），中藥湯劑6例（10.53%）。 合 并 癥 方 面，合 并 高 血 壓8 例（14.04%），冠狀動脈粥樣硬化性心臟病2 例（3.50%），慢性淺表性胃炎2例（3.50%）。（見表1）

2.2 miR-150-5p在RA 患者、健康人外周血的相對表達水平

相對于健康對照組，RA 患者的miR-150-5p 的相對表達水平明顯下降，有統計學差異（t = -19.019，P ＜0.05）。進一步將RA 患者組，劃分為穩定組和活動組，經One-way ANOVA 檢驗發現，與健康對照組相比，兩組患者的miR-150-5p 的相對表達水平明顯下降（F=149.298，P ＜0.05）。活動組比穩定組相比，有下降趨勢，但無統計學差異。（見表2）

表2 兩組受試者miR-150-5p的相對表達水平

表3 兩組受試者SOCS1 mRNA的相對表達水平（±s）

表3 兩組受試者SOCS1 mRNA的相對表達水平（±s）

注：RA：類風濕關節炎；HC：健康對照；穩定組定義：RA 患者DAS28-ESR < 3.2；活動組定義：RA 患者DAS28-ESR ≥3.2。#，與健康對照組相比，P<0.05。

SOCS1 mRNA 9.18±0.38 18.12±1.57#14.36±2.13#18.65±1.00#分組HC組（n=19）RA組（n=57）穩定組（n=7）活動組（n=50）

表4 RA的中醫證型分布

表5 中醫證型與miR-150-5p相對表達量的Logistic回歸分析（陽性結果）

圖1 雙熒光素酶報告基因分析結果

2.3 SOCS1 mRNA在RA及健康對照組的表達水平

相對于健康對照組，RA 患者的SOCS1 mRNA 的相對表達水平明顯升高，有統計學差異（t = 5.333，P ＜0.05）。進一步將RA 患者組，劃分為穩定組和活動組，經One-way ANOVA 檢驗發現，與健康對照組相比，兩組患者的SOCS1 mRNA 的相對表達水平明顯升高（F=6.421，P ＜0.05）。活動組比穩定組相比，有升高趨勢，但無統計學差異。（見表3）

2.4 miR-150-5p 降低了SOCS1 mRNA 3′-UTR 的穩定性

SOCS1 mRNA 的3′-UTR 序列的DNA 片段連接到雙熒光素酶載體的LUC2 基因的3′端，結合位點為GGGTTGGG。雙熒光素酶報告基因測定如下圖所示，與陰性對照mimics 組相比，miR-150 mimics 組的熒光素值明顯下降，差異具有統計學意義（25.46 ± 1.00 vs 21.84±0.19,P<0.05）。說明miR-150 mimics 降低了連接SOCS1 的3′UTR 序列的熒光蛋白質的mRNA 的水平，證明miR-150-5p與SOCS1靶向結合。（見圖1）。

2.5 miR-150-5p、SOCS1 mRNA對RA的診斷預測分析

以miR-150 的相對表達水平為檢驗變量構建ROC 曲 線，并 計 算 曲 線 下 面 積AUC 為0.974（P ＜0.05）。根據Youden 指數，其最佳界值為3.06（敏感性0.981，特異性0.920）。（見圖2A）。

以SOCS1 mRNA 相對表達水平為檢驗變量構建ROC 曲 線，并 計 算 曲 線 下 面 積AUC 為0.425（P ＞0.05）。故SOCS1 mRNA對RA的診斷無指導意義。（見圖2B）。

2.6 miR-150-5p與RA中醫證型的相關性分析

頻數統計分析發現，本研究中類風濕關節炎患者中風濕痹阻證（38.6%）、寒濕痹阻證（28.1%）、痰瘀痹阻證（14.0%）是常見證型。以miR-150-5p > 3.06，賦值0，miR-150-5p ≤3.06，賦 值1，經 無 序 多 分 類Logistic 回歸分析，發現miR-150-5p ≤3.06 人群，其患風濕痹阻證及寒濕痹阻證的風險分別為8.33 倍和250.00倍。（見表4、表5）

3 討論

圖2 miR-150-5p、SOCS1 mRNA相對表達量的ROC曲線

miRNA 主要通過與目標mRNA 的3′端相結合，在翻譯水平調控基因的表達。本研究通過雙熒光素酶法證明miR-150-5p 與SOCS1 mRNA 有靶向結合關系。再者，本研究測定外周全血miR-150-5p 和SOCS1 mRNA 的相對表達水平。相對于健康人群，miR-150-5p表達水平更低。Niimoto T 等[12]研究報道，相對于骨性關節炎患者，RA 患者外周血產IL-17 T 細胞中，miR-150-5p 顯著高表達，與本研究結果似不一致。另有Honda N 等[13]報道，在系統性硬化癥患者中，miR-150在外周血中低表達，與本研究結果似乎一致。可以看出，目前的研究結果報道各不一致，符合目前miRNAs 在RA 中的表達多樣性的特點[14]。究其原因：①可能與miR-150 的標本來源不同有關，因為同一miRNA 在不同組織或細胞中的表達可不同，甚至同一miRNA 在同一組織或細胞中，因檢測方法不同，其結果也有不同；②可能與研究對照不同有關。Niimoto T等進行的研究，其對照人群是骨性關節炎而非健康人群，導致對照標準不統一，因而結果可能無可比性。本研究同時發現，相對于健康人群，RA 患者的SOCS1mRNA 表達水平更高，與既往研究結果一致，進一步驗證了SOCS1 mRNA 在RA 中過表達的結論[15-17]。其原因可能為：①RA 患者TNF-a、IL-6、INF-γ 等促炎細胞因子可以激活JAK-STAT 通路，進而可導致SOCS1 表達的上調[18]；②從miR-150-5p 與SOCS1 相互作用的角度，本研究中SOCS1 水平升高的原因，可以用miR-150-5p水平下降來部分解釋。

RA 的西醫治療，雖取得了充足的進步，仍有患者因為診斷的延誤而導致疾病的不可逆性損害。而早期診斷本病，除了依靠類風濕因子、抗環瓜氨酸抗體等生物標志物，仍需不斷發現新的指標，以更早的發現RA 患者，達到早期治療，延緩病變進展的目的。通過AUC曲線，本研究發現miR-150-5p區分RA的敏感性和特異性分別達到了98.1%、92.0%，說明miR-150-5p 是RA 診斷的有效潛在生物標志物。遺憾的是，本研究發現未能發現SOCS1 mRNA 對RA 診斷的指導意義。

既往類風濕關節炎中醫癥候研究，大多停留在橫斷面調查分析層面，缺乏客觀化指標的確證[19-21]。作為中醫的“證”有即時性與差異性的特點，因為其是某一階段的情況，所以會處于不斷的動態變化之中。而miRNAs 及其表達的動態變化過程與臨床表現的癥狀和體征有內在的聯系，具有精確特異的時空表達特點，因此，其可能參與了證候的發生與動態變化[22]。因此，近年來，作為表觀遺傳學證據之一的microRNAs，在RA 的中醫證型相關研究中的重要性，逐步受到重視。本研究發現RA 患者的miRNA-150-5p 的相對表達水平，低于正常人群。miR-150-5p 其界值為3.06，其診斷為風濕痹阻證、寒濕痹阻證的相對危險度分別達到8.33、250.00，說明其是診斷風濕痹阻證、寒濕痹阻證等證型的有效指標。再者，本研究發現，風濕痹阻證、寒濕痹阻證是RA 的主要證型，而不是既往研究所列的濕熱痹阻證[19-21]。患者平素體虛，陽氣不足，衛外不固，腠理空虛，易為風、寒、濕、熱之邪乘虛侵襲，痹阻筋脈、肌肉、骨節，而致營衛行澀，經絡不通，發為本病。陽氣虛衰，寒氣內生，復感風寒濕邪，從陰化寒，而成為風寒濕痹[23]。因此，從病因病機來看，風濕痹阻證、寒濕痹阻證均可能是RA 的主要癥候。考慮到本研究的樣本量較小，需進一步擴大樣本量，以驗證本研究結果。

總之，本研究發現，miR-150-5p、SOCS1 mRNA 在RA 患者中的相對表達水平有差異性表達，且miR-150-5p 靶向結合于SOCS1 mRNA。miR-150-5p 可能作為RA 疾病診斷、中醫證型判斷的有力指標，可為“病”“證”結合的診斷提供參考。本研究存在一定的不足，即樣本量較小，可能存在一定的偏倚。因此，需謹慎解讀本研究結果。下一步，需結合基因芯片技術，擴大樣本量，發現更多特異性miRNAs，從而為RA的疾病診斷及中醫證型判斷提供更多更確切的客觀證據。