脂多糖結合蛋白在口腔鱗狀細胞癌患者中的變化及其意義

王爽 李翠萍 穆婷 馮浩然 黃旋平 何雨亮

廣西醫科大學附屬口腔醫院/廣西口腔頜面修復與重建研究自治區級重點實驗室/廣西顱頜面畸形臨床醫學研究中心/頜面外科疾病診治研究重點實驗室（廣西高校重點實驗室）（南寧530021）

口腔癌（oral cancer，OC）是一種起源于在口腔上皮組織的惡性腫瘤的總稱。根據國家癌癥研究所檢測估計，近10年間口腔及口咽癌的發病率平均每年上升0.8%。2009-2015年五年生存率為 65.3%［1］。口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是最常見的口腔癌，為全身第6位高發的惡性腫瘤［2］。據估計，全球每年新發病例超過30萬，死亡病例近15萬［3］。腫瘤復發、轉移是主要的致死原因。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁上的一種內毒素（endotoxin），體外研究表明LPS具有降低血管通透性、促進腫瘤細胞周圍血管生成的作用，可促腫瘤細胞遠處轉移［4-5］。脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）是LPS與CD14結合的靶點，對LPS介導的炎癥反應具有增敏作用，促進單核巨噬細胞產生上千倍的炎癥介質［6］，影響細胞微環境。已有數據證實，LBP可能會增加幽門螺桿菌感染導致胃癌的風險［7］。并且，外泌體LBP蛋白表達在轉移性非小細胞肺癌患者較非轉移性患者表達上調［8］。KOVACS［9］等研究發現 LBP 表達與腎細胞癌患者存活率有關，證實LBP的表達與腎細胞癌進展存在相關關系。由此可見，LBP在惡性腫瘤的發生、發展過程中，可能起到了一定的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 2017年9月至2018年6月廣西醫科大學附屬口腔醫院病理診斷為OSCC并接受手術治療的54例患者的癌組織及癌旁正常組織樣本。腫瘤中央處避開糜爛區切去癌組織2份，距腫瘤邊界＞2 cm取癌旁組織2份，RNA Keeper Tissue Stabilizer的EP管中與空管各1份，-80℃凍存。

1.1.2 血清樣本 2017年9月至2018年6月廣西醫科大學附屬口腔醫院病理診斷為OSCC的血液樣本159例，以及招募健康志愿者的血液樣本44例。離心2 000g15 min，取上清液，-80℃凍存。以上樣本收集經廣西醫科大學倫理委員會批準，經患者知情同意。

1.1.3 試劑與儀器 PCR：RNA Keeper Tissue Stabilizer（南京諾唯贊生物科技有限公司）Prime-ScriptTM RT Master Mix試劑盒（Takara Corporation，JPN）總RNA提取試劑盒（Promega Corporation，US）SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takara Corporation，JPN）引物（廣州擎科生物有限公司）：目的基因 LBP：上游序列 5′-GATGTCGCAAGCAGGTTCC-3′,下游序列 5′-AAGTAGCCAAGGCTCGATGG-3′。內參基因 GAPDH：上游序列 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游序列 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

ELISA：ExoQuick Exosome Precipitation solution（上海吉泰依科賽生物科技公司），BCA試劑盒（碧云天），人類LBP酶聯免疫吸附試劑盒（ab213805）（ABCAMCorporation，US）。

儀器：Step One Plus實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific，US），酶標儀（上海帝肯貿易有限公司），血常規分析儀檢（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司），全自動生化分析儀（HITACHI，JPN）。

1.2 方法

1.2.1 樣本RNA的提取及cDNA合成 取出RNA保護液中的癌與癌旁組織，剪碎，勻漿，總RNA提取試劑盒提取總RNA，PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒逆轉錄 cDNA［10］。

1.2.2 qPCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒配制20 μL反應體系，Step One Plus實時熒光定量 PCR 儀反應：（1）預變性：95 ℃ 30 s；（2）PCR：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；40循環；（3）熔解：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。記錄2-△△CT值［10］。

1.2.3 外泌體提取 250 μL血清加入63 μL Exo-Quick Exosome Precipitation solution，裂解外泌體，-80℃保存。BCA試劑盒測定樣品外泌體蛋白質濃度。加入5XSDS上樣緩沖液，變性95℃10 min，-80℃凍存。

1.2.4 標準夾心酶聯免疫吸附技術 應用人類LBP酶聯免疫吸附試劑盒（ab213805），將LBP抗體包被于96孔板上。加入標準品（標準的表達系統：NSO；免疫原序列：A26-V481）以及待測樣品，加入生物素化的LBP抗體。充分洗滌后加入抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物，PBS洗滌。HRP催化TMB產生藍色產物后終止反應。15 min內，空白調零，酶標儀450 nm波長下測定吸光度（OD值）。

1.2.5 血常規分析 檢測血清LBP蛋白水平檢測的OSCC患者白細胞計數、血小板計數、淋巴細胞絕對值、中性粒細胞絕對值。全自動生化分析儀檢測OSCC患者堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總蛋白水平。

1.3 統計學方法 應用SPSS 25.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差或中位數（四分位數間距）表示集中趨勢與離散程度。正態分布資料采用t檢驗，偏態分布資料采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。采用直線相關分析計算兩組計量資料的相關性，Pearson積差相關系數r表示相關關系。ROC曲線計算曲線下面積和敏感度。

2 結果

2.1 LBP mRNA在OSCC中的表達 OSCC癌組織中LBP mRNA的相對表達量為0.845（0.200，3.089），癌旁組織中表達量 1.000 02（1.000 01，1.00005），差異無統計學意義（P＞0.05）。臨床資料：TMN分期（AJCC 2010年第七版）：Ⅰ-Ⅱ期26例，Ⅲ-Ⅳ期28例。淋巴轉移：有轉移31例，無轉移23例。分化程度：高分化44例，中低分化10例。吸煙19例，不吸煙35例。飲酒18例，不飲酒36例。OSCC癌組織LBP mRNA表達在吸煙、飲酒的病例中，癌組織中LBP mRNA的相對表達量明顯較癌旁組織增高（P＜0.05）。其余分組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 OSCC癌組織中LBP mRNA相對表達量與患者臨床特征的關系Tab.1 Relationship between the relative expression of LBP mRNA in OSCC cancer tissues and clinical characteristics of patients

2.2 LBP蛋白在OSCC血清中的表達 OSCC血清中LBP蛋白的OD值（149.433±69.015）mg/L，明顯高于健康人血清OD值（102.380±31.956）mg/L（P＜0.05）。見圖2。OSCC血清中LBP蛋白表達量與患者淋巴結轉移、飲酒相關（P＜0.05），其余分組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖3。

圖1 吸煙與不吸煙OSCC癌組織LBP mRNA相對表達量比較（A）；飲酒與不飲酒OSCC癌組織LBP mRNA相對表達量比較（B）Fig.1 AComparison of the relative expression of LBP mRNA in smoking and no smoking OSCC cancer tissues（A）；Comparison of the relative expression of LBP mRNA in drinkingand no drinking OSCC cancer tissues（B）

圖2 OSCC患者血清與健康人血清LBP蛋白表達量比較Fig.2 Comparison of LBP protein expression in serum from OSCC patients and healthy people

圖3 健康對照組、淋巴結轉移與不轉移OSCC血清LBP蛋白表達量比較（A）；吸煙與不吸煙、飲酒與不飲酒OSCC血清LBP蛋白表達量比較（B）Fig.3 Comparison of LBP protein expression in serum from healthy controls，OSCC lymph node metastasis and nonmetastasis（A）；Comparison of LBP protein expression in serum from OSCC smoking and no smoking，drinking and no drinking（B）

2.3 LBP mRNA在OSCC患者血清中相對表達量 OSCC血清中LBP mRNA表達量為0.570（0.254，1.581），癌旁組織中表達量0.496（0.256，1.328），差異無統計學意義（P＞0.05）。在飲酒組中mRNA表達較不飲酒組升高（P＜0.05）。其余分組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖4。

表2 OSCC血清中LBP蛋白表達量與患者臨床特征的關系Tab.2 Relationship between the expression of LBP protein in OSCC serum and clinical characteristics of patients ±s

表2 OSCC血清中LBP蛋白表達量與患者臨床特征的關系Tab.2 Relationship between the expression of LBP protein in OSCC serum and clinical characteristics of patients ±s

臨床特征TNM分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ、Ⅳ期淋巴結轉移轉移未轉移分化程度高分化中、低分化吸煙情況吸煙不吸煙飲酒情況飲酒不飲酒26 28 141.782±75.899 156.538±62.5070.438 31 23 175.024±77.173 114.878±34.2330.000 44 10 144.971±74.770 160.070±28.5160.103 19 35 160.351±58.885 143.021±74.0840.352 18 36 199.698±59.652 124.301±59.4590.000例數LBP蛋白表達量（mg/L）P值

表3 OSCC血清中LBP mRNA相對表達量與患者臨床特征的關系Tab.3 Relationship between relative expression of LBP mRNA in OSCC serum and clinical characteristics of patients M（P25，P75）

圖4 飲酒與不飲酒OSCC血清中LBPmRNA相對表達量比較Fig.4 Comparison of LBP mRNA expression in serum from OSCC drinking and no drinking.

2.4 LBP蛋白在OSCC血清外泌體中表達 OSCC血清外泌體中LBP蛋白的OD值為（6.953±2.018）mg/L，健康人血清OD值（6.709±1.518）mg/L，差異無統計學意義（P＞0.05）。OSCC患者中淋巴結轉移、飲酒病例的血清外泌體中LBP蛋白表達量明顯增高（P＜0.05），其余分組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、圖5。

表4 OSCC血清外泌體中LBP蛋白表達量與患者臨床特征的關系Tab.4 Relationship between the expression of LBP protein in OSCC serum exosomes and clinical characteristics of patients±s

表4 OSCC血清外泌體中LBP蛋白表達量與患者臨床特征的關系Tab.4 Relationship between the expression of LBP protein in OSCC serum exosomes and clinical characteristics of patients±s

臨床特征TNM分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ、Ⅳ期淋巴結轉移轉移未轉移分化程度高分化中、低分化吸煙情況吸煙不吸煙飲酒情況飲酒不飲酒例數LBPmRNA相對表達量P值74 31 6.653±2.101 7.660±3.4490.138 54 51 8.328±2.645 5.498±1.551＜0.001 70 35 6.711±2.473 7.428±2.8040.183 48 57 7.283±2.756 6.674±2.4460.234 49 56 8.303±2.920 5.767±1.502＜0.001

2.5 OSCC患者血清LBP與一般生化指標相關性與ROC曲線 OSCC患者ALP、LDH、總蛋白與LBP存在一定線性關系。r值分別為0.340、0.568、-0.309。見表5。LBP、ALP、LDH、總蛋白 ROC曲線下面積分別為76.0%、86.1%、79.1%、77.1%；敏感度分別為為53.2%、72.2%、51.1%、72.2%。見表6、圖6。

圖5 淋巴結轉移與不轉移OSCC血清外泌體LBP蛋白表達量比較（A）；吸煙與不吸煙、飲酒與不飲酒OSCC血清外泌體LBP蛋白表達量比較（B）Fig.5 Comparison of LBP protein expression in serum exosomes from OSCC lymph node metastasis and no metastasis（A）；Comparison of LBP protein expression in serum exosomes from OSCC smoking and no smoking，drinking and no drinking OSCC（B）

3 討論

基因調控下的細胞自身結構與胞外環境的改變是腫瘤細胞發生的基礎，其往往伴隨著細胞微環境的紊亂［11］。OSCC中常見腫瘤細胞周圍炎癥浸潤［12］。這種不平衡的病理環境，在影響腫瘤細胞蛋白表達的同時，與免疫系統產生一系列相互作用，進一步促進腫瘤細胞的增殖、遷移［13］。近年來，對于OSCC微環境的研究成為目前的研究熱點。本文章探討LBP作為Ⅰ型急性期反應蛋白對OSCC影響。

腫瘤來源外泌體（Tumour derived exosomes，TDE）是目前公認的人體血清中最容易發現具有特異性的腫瘤標志物的研究對象［14-15］。前期實驗中，筆者通過對OSCC患者與正常人血清外泌體（Exosomes）進行了蛋白質組學分析，發現淋巴結轉移組OSCC中LBP蛋白有上調趨勢。表明血清外泌體中LBP含量在淋巴結轉移OSCC患者中明顯高于非淋巴結轉移患者。由此可見，外泌體LBP可能是促進OSCC轉移的驅動因子之一。

表5 OSCC血清中LBP蛋白表達量與患者一般生化指標的相關Tab.5 Correlation between LBP protein expressions and general biochemical indicators of patients in OSCC serum

表6 OSCC血清中LBP蛋白表達量與一般生化指標ROC曲線數據Tab.6 The ROC curve data of LBP protein expression and general biochemical

圖6 LBP、ALP、LDH、總蛋白ROC曲線Fig.6 ROC curves of LBP,ALP,LDH,and total protein

本次實驗研究發現，OSCC人體血清中的LBP蛋白含量較健康人的含量顯著提高。相比血清外泌體LBP表達，循環LBP診斷效能大于外泌體LBP。淋巴結轉移OSCC患者LBP血清蛋白表達量也較健康人明顯增加。表明LBP蛋白可以在循環血清中被穩定檢測并可能作為診斷OSCC的生物標志物。

為了進一步明確血清LBP對于OSCC診斷價值，筆者分析了LBP與OSCC患者血清一般生化指標之間的關系，發現LBP與LDH、ALP、總蛋白具有一定的線性相關關系。其中與LDH相關性最為顯著。目前，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）已被納入血清腫瘤標志物。惡性腫瘤中LDH水平升高歸因于細胞有絲分裂增多導致糖蛋白分解產生的大量乳酸［16］。血清LDH與OSCC相關性在諸多研究中被證實［17-18］。OSCC好發部位靠近頜骨，腫瘤頜骨轉移是OSCC常見的并發癥。血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）由一般由骨細胞產生，并在惡性腫瘤骨轉移患者中大量表達［19］。OSCC主要因影響患者進食和惡性腫瘤消耗而影響機體總蛋白水平。通過對LBP與LDH、ALP、總蛋白對OSCC診斷的敏感度的比較，發現ALP=總蛋白＞LBP＞LDH。上述結果證實血清LBP與OSCC存在某種關聯性并對OSCC具有診斷價值。具體的作用機制有待進一步探究。

此外，筆者整理了OSCC患者的一般臨床資料，進一步分析對OSCC發生發展的影響因素。結果表明，吸煙、飲酒的OSCC患者癌組織LBP mRNA相對表達量明顯高于不吸煙、不飲酒患者，證實了吸煙、飲酒是促進OSCC發生、增殖的局部促進因素。飲酒組血清、血清外泌體蛋白表達，血清mRNA表達均上調，表明飲酒相對于吸煙而言對OSCC具有更大的全身促進作用。吸煙、飲酒是OSCC主要危險因素［20］。嚴重和長期的吸煙和飲酒習慣會顯著增加觸發OSCC的風險［21］。此次研究對OSCC早期防治工作目前開展提供了相對明確方向。

LBP與革蘭氏陰性細菌脂多糖（LPS）在CD14細胞上形成高親和力的復合物，可促進巨噬細胞產生大量的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［6］。TANG 等［22］證實 TNF-α可以通過 NF-κB信號通路增強OSCC細胞的侵襲和轉移能力。TNF-α的表達上調可以導致OSCC周圍血管生成，促進細胞增殖、遷移［23］。LPS通路基因多態性TLR2，TLR4，MD-2，LBP，和CD14均能增加導致幽門螺桿菌感染和胃癌的風險［7，24］。由此筆者推測LPS通路可能是影響OSCC進展的途徑之一。目前尚無關于LBP對與OSCC作用機制的研究。本課題組在以后的研究中會進一步研究LBP在LPS相關信號通路中對OSCC的影響。

綜上所述，LBP可能是診斷OSCC轉移的生物學標志和化療藥物靶向治療的新的突破口。筆者使用了蛋白質組學和基因組學技術尋找OSCC診斷標志物，為OSCC早期防治、早期診斷以及預后提供理論依據，拓寬了研究OSCC發生、發展機制的新思路。