芪黃疽愈方對ASOLE大鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)因子表達(dá)的影響?

張 靜，葛建立，張 欣，張敏妹，何建明，李曉東，馬云龍，孫云朝，楚信強，白建英

(1.河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200；2.河北省中醫(yī)院，石家莊 050011；3.石家莊市中醫(yī)院，石家莊 050051)

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis occlusive disease of the lower extremities,ASOLE)是動脈硬化在下肢的特殊表現(xiàn)[1-2]。動脈硬化發(fā)病原因及形成機制復(fù)雜[2-4]，肝臟B類Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class b type Ⅰ,SR-BⅠ)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等對動脈硬化的形成具有重要調(diào)控作用[5-7]。課題組既往的臨床研究證實[8]，芪黃疽愈方能夠有效改善ASOLE患者臨床癥狀，但具體生物學(xué)機制尚不明確。本研究以ASOLE大鼠為實驗對象，通過觀察芪黃疽愈方對肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1等因子表達(dá)的影響，探討其治療ASOLE的分子生物學(xué)機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級Wistar大鼠58只，9±1個月齡，體質(zhì)量200±20 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號1704031，由河北中醫(yī)學(xué)院實驗樓喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為獨立的不銹鋼通氣籠，每籠5只，動物房溫度23 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%，明暗光照各12 h交替進(jìn)行。實驗用普通全價顆粒飼料和高脂飼料均購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。本實驗已通過河北中醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物

芪黃疽愈方中藥飲片由紅花、雞血藤、海藻、浙貝母、鬼箭羽、蟲、延胡索、黃芪、黃精、牛膝組成，由國藥樂仁堂石家莊藥材有限公司生產(chǎn)；維生素D3針劑由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

兔抗SR-BⅠ一抗(Abcam，貨號：ab52629)；山羊抗兔二抗-HRP(Easybio，貨號：BE0106)；ECL顯色試劑盒(Thermo，貨號：34094)；PPAR-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、MCP-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，貨號：ml0045637、ml0022423，購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司。

1.4 儀器

Western Blot電泳儀基礎(chǔ)電源 PowerPacTMBasic(BIO-RAD公司)；近紅外雙色激光成像系統(tǒng)(Odyssey公司)；HBS-1096C Pro自動酶標(biāo)儀(上海珂淮儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機取10只作為正常組，余下大鼠采用高脂飲食加隱動脈內(nèi)膜損傷的方法[9]制作ASOLE模型。1%戊苯巴比妥鈉(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉，左后肢消毒，從腹股溝中點向后肢內(nèi)側(cè)縱行切開皮膚，分離并暴露隱動脈，用動脈夾阻斷隱動脈遠(yuǎn)近端約1.8±0.1 cm，取胰島素注射器1支，沿隱動脈血管長軸由遠(yuǎn)端向近端刺入血管腔，將0.25 mL注射用無菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管，5 min后取下針頭和動脈夾，壓迫止血并縫合切口。并在實驗開始時在大鼠右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3×105u/kg)，每隔30 d重復(fù)1次。采用隨機數(shù)字表法將ASOLE大鼠分為模型組、芪黃疽愈方高濃度組、中濃度組、低濃度組各12只。實驗期間模型組和中藥組持續(xù)高脂飼料(83.5%基礎(chǔ)飼料，5%豬油，1%膽固醇，0.5%膽酸鈉及10%蛋黃粉[10])喂養(yǎng)，空白組普通飼料喂養(yǎng)，均自由飲水。

2.2 給藥方法

芪黃疽愈方組成：紅花12 g，雞血藤15 g，海藻12 g，浙貝母12 g，鬼箭羽12 g，蟲9 g，延胡索12 g，黃芪20 g，黃精12 g，牛膝9 g。按原方的組方比例，并根據(jù)體表面積比率折算出200 g大鼠的等效用藥劑量作為其用量，另取其1/2劑量和2倍劑量作為芪黃疽愈方低濃度和芪黃疽愈方高濃度組。由河北省中醫(yī)院煎藥室煎制，4 ℃冰箱保存1周內(nèi)使用；芪黃疽愈方中濃度組的藥物最終濃度0.4 g生藥/mL，低濃度組0.2 g生藥/mL，高濃度組0.8 g生藥/mL，實驗過程中每次中藥制劑均按同一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

造模后1周，模型組和中藥組(芪黃疽愈方低濃度組、中濃度組、高濃度組)分別給予生理鹽水(1 ml/100 g)或相應(yīng)濃度中藥灌胃(1 ml/100 g)，每日1次，連續(xù)12周，空白組大鼠則不予處理。

2.3 標(biāo)本采集及處理方法

取材前夜禁食水。10%水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)腹腔麻醉，剪開皮膚摘取肝臟組織，切割標(biāo)本后，一部分勻漿充分后離心20 min左右(2000～3000 r/min)，仔細(xì)收集上清液用于ELISA檢測；一部分直接裝入凍存管中，-80 ℃保存，待行Western印跡法檢測。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 一般狀態(tài) 觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、毛色、活動靈敏度、飲食、飲水及體質(zhì)量。

2.4.2 Western印跡法測定肝臟SR-BⅠ表達(dá) 制備SDS-PAGE膠板，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合，于95 ℃變性10 min后迅速置于冰水中冷卻，依次加樣。恒壓電泳，恒流濕轉(zhuǎn)，封閉1 h后依次與一抗(兔抗SR-BⅠ，1∶1000稀釋)孵育過夜，洗滌后放入二抗(山羊抗兔)孵育1 h，曝光顯色后掃描處理，所得條帶吸光度值分別與對應(yīng)內(nèi)參計算比值獲得相對吸光度值[11-12]。

2.4.3 ELISA法檢測肝臟PPAR-α、MCP-1表達(dá) 根據(jù)試劑盒說明書嚴(yán)格操作，采用ELISA法檢測肝臟PPAR-α、MCP-1表達(dá)水平。加樣、加酶、溫育(37 ℃，60 min)配液，洗滌、顯色(37 ℃，15 min)、終止，450 nm波長檢測吸光度值(OD值)[13]。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)

實驗發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠毛色光澤，活動靈敏，飲食、飲水量正常，體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時間延長而增加；模型組、中藥組大鼠在最初1個月增長迅速，后增長速度減緩，其精神萎靡，活動欠靈敏，毛色暗淡，食量相對正常組也減少。直至實驗藥物干預(yù)12周結(jié)束時，除模型組、中藥低濃度組各死亡1只外，其余各組均無大鼠死亡。

3.2 各組大鼠肝臟組織SR-BⅠ表達(dá)水平比較

圖1示，與空白組比較，模型組SR-BⅠ的表達(dá)明顯降低；與模型組比較，中藥各濃度組SR-BⅠ的表達(dá)明顯升高，且SR-BⅠ的表達(dá)水平隨中藥濃度增加而升高。

圖1 各組大鼠肝臟組織SR-BⅠ蛋白免疫印跡條帶圖

3.3 各組大鼠肝臟組織PPAR-α、MCP-1水平比較

與空白組比較，模型組大鼠肝臟PPAR-α顯著性下降(P<0.01)。中藥處理有效升高大鼠肝臟PPAR-α水平，效果與藥物濃度呈正相關(guān)；高、中濃度組較模型組顯著性升高(P<0.01)，低濃度組較模型組雖有上升但無統(tǒng)計學(xué)意義。

與空白組比較，模型組大鼠肝臟MCP-1顯著性上升(P<0.05)。中藥處理有效降低大鼠肝臟MCP-1水平，效果與藥物濃度呈正相關(guān)；高濃度組較模型組顯著性降低(P<0.01)，中、低濃度組較模型組雖有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 各組大鼠肝臟組織PPAR-α、MCP-1檢測結(jié)果比較

4 討論

脂代謝異常導(dǎo)致高炎癥狀態(tài)是動脈硬化形成的核心機制[3、14]。肝臟是機體調(diào)節(jié)血脂水平的主要臟器之一[5、15-17]，通過調(diào)節(jié)血脂改變機體炎癥狀態(tài)是其參與動脈硬化形成、預(yù)防、治療的重要機制[3、14、18]。肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1在調(diào)節(jié)血漿膽固醇、脂肪酸等血脂水平及機體炎癥狀態(tài)中發(fā)揮了重要作用。SR-BⅠ參與肝細(xì)胞選擇性攝取血漿結(jié)合膽固醇(主要為高密度脂蛋白膽固醇)，也是協(xié)助肝細(xì)胞將代謝后的膽固醇通過膽汁，經(jīng)膽道、腸道排出體外的重要分子[5、17]。肝細(xì)胞內(nèi)活化的PPAR-α通過調(diào)節(jié)參與脂肪酸轉(zhuǎn)運、結(jié)合、活化過氧化物酶和線粒體的脂肪酸β氧化的相關(guān)基因，促進(jìn)脂肪酸的攝取、利用和分解代謝[6、19]。MCP-1具有趨化單核細(xì)胞等功能[20、21]。單核-巨噬系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運血脂的功能，同時也是參與炎癥的重要細(xì)胞[7]。因而，肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1在調(diào)節(jié)血脂、降低機體炎癥水平、抗動脈硬化中扮演著重要角色。

高脂飲食加隱動脈內(nèi)膜損傷是目前較為成熟且被廣泛接受研究ASOLE的模型方法[9]。本實驗利用該模型研究芪黃疽愈方治療ASOLE的作用機制。模型組血管壁結(jié)構(gòu)破壞且顯著性增厚，可見泡沫細(xì)胞浸潤血管壁等，基本符合動脈硬化的病理表現(xiàn)，驗證了此方法的有效性。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，芪黃疽愈方顯著性升高肝細(xì)胞SR-BⅠ、PPAR-α表達(dá)，降低肝臟MCP-1水平。結(jié)合課題組既往的研究報道[22]，即調(diào)節(jié)血脂參與芪黃疽愈方治療ASOLE的機制，說明調(diào)節(jié)肝臟SR-BⅠ、PPAR-α、MCP-1表達(dá)應(yīng)是其調(diào)節(jié)血脂降低機體炎癥狀態(tài)，治療ASOLE的具體機制之一。

本病屬于中醫(yī)學(xué)“脫疽”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，癥積阻絡(luò)不通、氣血周流受阻是導(dǎo)致ASO的病機關(guān)鍵，故治療ASOLE需以消癥通絡(luò)為基本法則。目前研究證實，活血、消癥、通絡(luò)、益氣的單味中藥具有抗動脈硬化、促進(jìn)下肢血液循環(huán)的作用。藥理學(xué)研究表明，紅花主要成分為羥基紅花黃色素A等，可以降低膽固醇，防止動脈硬化及機體代謝紊亂[23-24]。雞血藤醇提物有較好的調(diào)節(jié)血脂和抗脂質(zhì)過氧化作用[25]；浙貝母能降低全血黏度，抑制紅細(xì)胞聚集[26]；海藻可有效提高高密度脂蛋白水平，加速低密度脂蛋白代謝，阻止氧化低密度脂蛋白所引發(fā)的對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[27]。“芪黃疽愈方”是本院治療ASOLE的經(jīng)典方劑，方中紅花、雞血藤活血化瘀通絡(luò)，浙貝母、海藻化痰散結(jié)，四藥合用消癥通絡(luò)為君藥；鬼箭羽、蟲、延胡索協(xié)助主藥增強活血化瘀之效為臣藥；黃芪、黃精益氣養(yǎng)陰固本為佐藥；使以牛膝引血下行。諸藥合用，標(biāo)本兼治，使癥積得化，經(jīng)絡(luò)暢通，諸癥悉除。早期臨床應(yīng)用“芪黃疽愈方”治療ASOLE取得了滿意療效，但作用機理不明。課題組在前期臨床研究的基礎(chǔ)上，以“芪黃疽愈方”對ASOLE大鼠進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步檢測組方藥效，探討作用機理。結(jié)果表明，芪黃疽愈方能夠有效促進(jìn)SR-BⅠ蛋白表達(dá)，升高PPARα，降低MCP-1，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低炎癥反應(yīng)，治療ASOLE，但其深入的作用機制尚待進(jìn)一步探討。