艾灸足三里對(duì)化療后骨髓抑制小鼠Notch信號(hào)通路的影響

葉 強(qiáng)，高 彤，梁花花，王亞軍

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿系，蘭州 730000)

目前在臨床上化療是手術(shù)、放療等的輔助療法，同時(shí)也是某些癌癥患者的主要療法。化療對(duì)腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制效果，可明顯改善臨床結(jié)局。但是由于非靶向化療藥物缺乏對(duì)細(xì)胞識(shí)別的特異性，使其對(duì)正常體細(xì)胞具有明顯的毒性，這其中尤以化療藥物的骨髓抑制作用導(dǎo)致的免疫抑制毒性最為突出。

中醫(yī)在降低化療藥物毒性方面取得了較好效果。張志民等[1]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在化療期間給予患者中醫(yī)扶正培本法治療，可以使急性白血病患者的胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、肝功能損害、腎功能損害的發(fā)生率明顯降低，周?chē)Ｒ?guī)明顯升高。另外還發(fā)現(xiàn)，正茂扶正顆粒[2]、黃芪注射液[3]、參麥注射液[4]、健脾益腎補(bǔ)血法[5]等多種中藥單體或復(fù)方均可降低化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性，提高免疫力，緩解化療副作用。大量基礎(chǔ)研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，艾灸對(duì)于化療藥物的骨髓抑制同樣具有明顯的改善作用。足三里是中醫(yī)降低化療藥物細(xì)胞毒性，改善骨髓抑制最常用的穴位[9-10]，艾灸足三里已被證實(shí)在基礎(chǔ)或臨床均可有效降低化療的毒副作用[11-12]，但其分子機(jī)制尚不清楚。本研究將在小鼠體內(nèi)建造骨髓抑制模型，通過(guò)艾灸足三里觀察其對(duì)骨髓抑制的治療作用，并通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法，初步探索其治療機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及分組

所有無(wú)特定病原體SPF級(jí)雄性C57BL/6 J小鼠，體質(zhì)量16～22 g，6～8周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0008；Lewis肺癌荷瘤小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2014-0008。所有小鼠均在25 ℃、12 h/12 h的光照周期下自然飲食飲水飼養(yǎng)，并在實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 試劑及儀器

環(huán)磷酰胺(CTX)(上海華聯(lián)制藥有限公司，060310)；艾條(李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)；4%多聚甲醛(北京Solarbio生物科技有限公司，P1110)；兔鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(SP)免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP9001)；蘇木素伊紅染液試劑盒(北京Solarbio生物科技有限公司，G1120)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0013B)；兔抗CBF-1/Suppressor of hairless/Lag(CSL)；多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，ab229866)；兔抗Jagged1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1448R)；兔抗Jagged2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-4244R)；兔抗Notch1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1335R)；兔抗Notch2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-21663R)；兔抗Nocth3多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1812R)；Trizol(大連Takara生物技術(shù)有限公司，9109)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara生物技術(shù)有限公司，RR047 A)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(rtPCR)試劑盒(大連Takara生物技術(shù)有限公司，RR820 A)；Leica切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，RM2235)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司，PROTEAN)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司，T100)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Appliedbiosystems公司，StepOnePlus)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型分組及其建立

32只雄性SPF級(jí)無(wú)特定病原體C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、空白組、模型組和治療組每組8只。骨髓抑制模型的建立[13]：無(wú)菌條件下剝離Lewis肺癌鼠瘤塊制成勻漿，調(diào)整至細(xì)胞濃度1 ×107/L，取0.2 ml 接種于每只C57BL/6 J小鼠腋下。接種第7 天選擇腫瘤大小相似的荷瘤鼠，腹腔注射 CTX 100 mg·kg-1·d-1，連續(xù)3 d，制成骨髓抑制模型。

2.2 取穴方法

根據(jù)華興邦等[14]研究，小鼠“足三里”位于腓骨小頭下約 5 mm 處，后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)。

2.3 分組與治療

荷瘤鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、治療組，另設(shè)模擬接種的正常組，每組各8只。其中正常組在相同位置接種相同體積但無(wú)腫瘤細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液(PBS)，模型組腹腔注射CTX制成骨髓抑制模型，灌服生理鹽水0.4 ml/d，連續(xù)5 d；治療組腹腔注射 CTX 造模，灌服生理鹽水0.4 ml/d，同時(shí)將艾條點(diǎn)燃后，高度固定在距離穴位皮膚 2 cm 處，時(shí)間為3 min，每日治療1次，連續(xù)治療5 d；空白組與正常組每天陪同抓取、固定不治療。

2.4 一般狀況觀察

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天記錄各組小鼠體質(zhì)量、飲食、大小便、活動(dòng)、精神狀況及外觀變化等。

2.5 血常規(guī)檢測(cè)

各組小鼠在造模前后與治療期間共8 d時(shí)間內(nèi)每天早上 7∶30經(jīng)尾靜脈取血10 μL，置于事先加好 390 μL 3%冰乙酸稀釋液的試管中，用以檢測(cè)外周白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.6 取材

治療5 d后，各組8只小鼠脫頸處死，在放置干冰的超凈工作臺(tái)上取兩側(cè)股骨，剔凈骨頭后用生理鹽水沖洗，在75%乙醇中浸泡2 min后再用生理鹽水沖洗，一側(cè)股骨立即放入4%多聚甲醛中固定并脫鈣；另一側(cè)股骨再用無(wú)RNase的生理鹽水沖洗后，在無(wú)RNase的環(huán)境下用無(wú)RNase的PBS沖出其中的骨髓細(xì)胞，將所得細(xì)胞分成2份，分別于2000rpm離心5 min后，立即提取RNA和蛋白質(zhì)。

2.7 HE病理檢測(cè)

將充分固定和脫鈣的股骨做石蠟切片后，石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后放入蘇木素染色，隨后0.5%鹽酸乙醇分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。再用95%乙醇浸泡后伊紅染色30 s，經(jīng)梯度酒精和二甲苯脫水，中性樹(shù)膠封片、拍照。

2.8 免疫組化檢測(cè)骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白的變化

將充分固定和脫鈣的股骨做石蠟切片后，按照1.2.5下過(guò)程對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化，然后將水化的切片放入10mM的pH6.0枸櫞酸鈉溶液中進(jìn)行微波-酸修復(fù)，PBS洗滌3次，滴加3%過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗滌，山羊血清37 ℃封閉10 min傾去勿洗，滴加一抗(稀釋比例)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉素37 ℃孵育30 min，PBS洗滌，滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)反應(yīng)液顯色適宜，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡拍照，采用ImageProPlus軟件對(duì)陽(yáng)性顆粒進(jìn)行測(cè)量。

2.9 Western bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3信號(hào)通路相關(guān)蛋白

骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)離心后，每1×106-7個(gè)細(xì)胞加入含有1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液500 μL，在冰上裂解30 min，13000rpm離心15 min，取上清10 μL進(jìn)行蛋白定量。另外上清加入5×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，依次經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，室溫孵育二抗2 h后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，自動(dòng)曝光儀進(jìn)行曝光、拍照，半定量分析條帶。

2.10 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3信號(hào)通路相關(guān)mRNA

在無(wú)RNase條件下骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)離心后，每1×106-7個(gè)細(xì)胞加入Trizol 500 μL，充分裂解細(xì)胞后，12000rpm離心5 min取上清，加入氯仿混勻后室溫靜置5 min，12000rpm離心5 min，取上層水相，加入等體積的異丙醇，室溫靜置5 min；12000rpm離心10 min，管底可見(jiàn)微量RNA沉淀；棄去上清，加入75%乙醇1 mL，懸浮沉淀；12000rpm離心10 min，棄上清，室溫干燥10 min；用20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA；然后依次經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)RNA進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的程序如下：Step1：95 ℃ 30 s；Step2：95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s；step3：GOTO step2，共計(jì)45 個(gè)循環(huán)數(shù)。

表1 引物序列

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)觀察

正常組與空白組從造模到治療結(jié)束，小鼠體質(zhì)量增加 1～3 g 不等，精神佳，毛發(fā)稠密，毛色光澤，飲食飲水正常，大小便正常，動(dòng)作靈活，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏；模型組小鼠從造模到治療結(jié)束，小鼠體質(zhì)量下降 1～3 g 不等，精神差，毛發(fā)稀疏，毛色暗淡無(wú)光，大便溏，個(gè)別小鼠有血便，進(jìn)食飲水量減少，行動(dòng)遲緩，多鼠扎堆，對(duì)外界刺激反應(yīng)降低；艾灸組小鼠造模后出現(xiàn)體質(zhì)量下降 1～3 g不等，精神差，毛色暗淡無(wú)光，進(jìn)食飲水量減少，行動(dòng)遲緩等情況；治療5 d后體質(zhì)量基本維持在原基數(shù)水平，皮毛尚有光澤，進(jìn)食飲水量正常，大便正常，無(wú)扎堆情況，活動(dòng)基本正常，對(duì)外界刺激反應(yīng)尚可，較模型組有所改善。

3.2 各組小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)目變化

表2示，正常組及空白組在造模前后的整個(gè)過(guò)程中，外周血白細(xì)胞數(shù)目未發(fā)生顯著性變化；模型組和艾灸組小鼠在造模前白細(xì)胞數(shù)目正常，第1次造模后第2天起二者外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，并隨造模時(shí)間的增加和造模次數(shù)的增多，白細(xì)胞數(shù)目逐漸顯著下降(P<0.05)。

表2示，正常組、空白組及模型組在治療前后的整個(gè)過(guò)程中，外周血白細(xì)胞數(shù)目未發(fā)生顯著性變化，其中正常組、空白組小鼠保持在正常范圍內(nèi)，模型組小鼠保持在低水平范圍內(nèi)；艾灸組小鼠在治療前白細(xì)胞數(shù)目很少，隨治療時(shí)間的增加白細(xì)胞數(shù)目逐漸顯著升高，至第5天時(shí)已達(dá)到正常水平(P<0.05)。

表2 CTX造模前后及治療前后各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化比較

3.3 各組小鼠骨髓病理變化

正常組和空白組骨髓組織結(jié)構(gòu)保持完整，骨髓細(xì)胞均一分布；模型組小鼠骨髓組織的結(jié)構(gòu)遭到破壞，骨髓細(xì)胞分布紊亂，細(xì)胞密度減少；治療組小鼠骨髓組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，骨髓細(xì)胞密度上升，結(jié)構(gòu)完整(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組小鼠骨髓病理變化比較(×200)

3.4 各組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白的變化

圖2示，正常組和空白組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白變化無(wú)差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠比較，艾灸組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

注：A.CSL、Jagged1、Jagged2的免疫組化圖；B.各蛋白表達(dá)量的半定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù);與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較： ##P<0.01圖2 各組小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2蛋白變化比較(×200)

3.5 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白的變化

正常組和空白組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白變化無(wú)差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；圖3示，與模型組小鼠比較，艾灸組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

注：A.Western bloting蛋白條帶；B.蛋白條帶的統(tǒng)計(jì)分析，與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖3 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3蛋白變化比較

3.6 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA的變化

圖4示，正常組和空白組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA變化無(wú)差異。與空白組小鼠比較，模型組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與模型組小鼠比較，艾灸組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖4 各組小鼠骨髓組織中Notch1、Notch2、Notch3 mRNA變化比較

4 討論

根據(jù)2018年全球腫瘤年報(bào)[15]，2018年全球新增1800萬(wàn)癌癥病例及960萬(wàn)癌癥死亡病例中，中國(guó)新增病例數(shù)占380.4萬(wàn)例，死亡病例數(shù)占229.6萬(wàn)例，發(fā)病率、死亡率均為全球第一。在治療方面，手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)腫瘤療法是我國(guó)臨床及患者的首要選擇。大部分化療藥物是基于腫瘤細(xì)胞與正常體細(xì)胞之間的增殖差異研發(fā)的，通過(guò)抑制細(xì)胞的DNA合成，阻止腫瘤快速增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。成年人的大部分體細(xì)胞均處于非增殖狀態(tài)或緩慢增殖狀態(tài)，化療藥物對(duì)其具有較低的抑制毒性，但是骨髓細(xì)胞及其免疫系統(tǒng)細(xì)胞需要時(shí)刻保持高速的增殖速度，以面對(duì)內(nèi)外環(huán)境引起的免疫反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體。因此在化療過(guò)程中，化療藥物對(duì)骨髓細(xì)胞增殖抑制造成的患者免疫抑制，使患者極易發(fā)生感染、出血，影響其癌癥治療和生活質(zhì)量，增加額外的治療成本，甚至威脅生命，因此降低化療藥物的骨髓抑制毒性對(duì)患者具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體上采用艾灸足三里穴位的療法，可有效升高由于化療藥物CTX所導(dǎo)致的減少血液白細(xì)胞數(shù)目，逆轉(zhuǎn)改善化療藥物所造成的骨髓組織破壞，解除CTX對(duì)骨髓的抑制作用。與前人研究結(jié)果一致。

但是艾灸足三里改善化療藥物的骨髓抑制分子機(jī)制目前尚不清楚，相關(guān)研究比較少。研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路與骨髓的造血功能密切相關(guān)，在造血細(xì)胞發(fā)育的不同階段，Notch 通路可影響其生存、增殖及分化，包括造血干細(xì)胞的自我更新及分化[16]；在T 祖細(xì)胞進(jìn)入胸腺發(fā)育的過(guò)程中，均有 Notch 信號(hào)通路的參與[17]，且 Notch 信號(hào)通路可促進(jìn) T細(xì)胞的發(fā)育，抑制B細(xì)胞發(fā)育[18]；現(xiàn)在更多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤性疾病與Notch 信號(hào)通路的活化密切關(guān)系[19]，因此本研究將基于Nocth信號(hào)通路，研究艾灸足三里改善化療藥物骨髓抑制的分子機(jī)制。

Notch信號(hào)通路由Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、Notch配體(Delta-like 1,3,4，Jagged1和Jagged2)、CSL DNA結(jié)合蛋白及其他效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過(guò)相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用實(shí)現(xiàn)的。Notch蛋白經(jīng)過(guò)3次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合,形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop- helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)化療藥物CTX干預(yù)后，在蛋白水平上小鼠骨髓組織中CSL、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3蛋白表達(dá)均受到抑制，同時(shí)在mRNA水平Notch1、Notch2、Notch3的表達(dá)同樣顯著下降。但是經(jīng)過(guò)艾灸足三里治療后，骨髓抑制模型小鼠骨髓組織中表達(dá)或激活被抑制的CSL、Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3蛋白均解除了抑制，表達(dá)水平均顯著升高，在mRNA水平Notch1、Notch2、Notch3的表達(dá)同樣顯著上升。以上提示，艾灸足三里可激活骨髓抑制模型中被抑制的Notch信號(hào)通路，這可能與其減輕化療藥物骨髓抑制密切相關(guān)，但具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上可知，CTX可降低骨髓組織中Notch信號(hào)通路的激活程度，產(chǎn)生骨髓抑制。艾灸足三里可導(dǎo)致骨髓抑制模型的骨髓組織中Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)升高，激活Notch信號(hào)通路，治療或緩解化療藥物導(dǎo)致的骨髓抑制，但其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。