電針對功能性消化不良肝郁脾虛大鼠十二指腸黏膜機械屏障及其調節蛋白的影響?

王 丹，張紅星△，榮培晶，侯理偉，李少源，王 瑜，王俊英，張金鈴，趙 斌，國 笑，張 悅，張紫璇，王藝霏，何家愷，韓永麗

(1.湖北中醫藥大學，武漢 430061；2.中國中醫科學院，北京 100700)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)屬于中醫學功能性胃腸病范疇，主要表現為上腹痛或灼燒、餐后早飽、腹脹等，且并無引起這些癥狀的其他疾病，消化系統也無任何器質性病變[1-2]?，F階段主要認為，FD的發病可能與腦腸互動異常、幽門螺桿菌感染、胃腸動力障礙、內臟高敏感性、腸道菌群失調、心理及精神因素、谷物過敏(小麥不耐受)以及腸黏膜屏障受損等因素有關[3-4]。眾所周知，腸黏膜屏障是防止腸內毒素等有害物質進入人體的重要防護屏障。若腸黏膜屏障受損，則腸腔內抗原、菌群、內毒素等有害因子進入腸深層甚至循環全身，導致各種疾病發生。腸黏膜屏障分為機械屏障、化學屏障、免疫屏障及生物屏障。機械屏障主要由腸上皮細胞和頂端連接復合體(apical junctional complex，AJC)構成。緊密連接(tight junction，TJ)屬于AJC，可調控細胞旁通道，調節腸黏膜通透性，防止抗原物質進入腸黏膜。閉合蛋白(Occludin)和閉鎖小帶蛋白(ZO-1)均是重要的腸上皮TJP，其二者形成穩定的連接，對腸黏膜屏障的完整性有非常重要的意義[5]。有研究發現[4,6]，FD患者存在十二指腸屏障功能受損。本課題組前期研究發現，電針干預可提高FD肝郁脾虛大鼠小腸推進率，提示電針能改善FD相關癥狀[7]。因此，本研究從十二指腸機械屏障角度探究電針治療FD新靶點及FD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級雄性SD大鼠30只，約6～7周齡，體質量(200±20)g，由三峽大學實驗動物中心提供,合格證號SCXK(鄂)2017-0012。經湖北中醫藥大學實驗動物福利委員會許可，飼養于湖北中醫藥大學SPF動物房，12 h/12 h明暗交替，室溫22 ℃～25 ℃，相對濕度50%～70%,每籠5只，適應性喂養1周后開始試驗,喂養期間自由飲水、攝食。

1.2 主要試劑與儀器

ZO-1抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號21773-1-AP)；Occludin抗體(英國Abcam生物技術有限公司，批號Ab216327)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，BA1054)；水合氯醛(上海國藥集團公司，批號40935760)；二甲苯(上海國藥集團公司，批號10023418)；蘇木素(美國Sigma公司，批號H9627)。

華佗牌0.35×25 mm(1寸)無菌針灸針(蘇州醫療用品廠有限公司)；韓式穴位神經刺激儀(南京濟生醫療科技有限公司，HANS-200 A);病理切片機(德國Leica公司，RM 2016輪轉式切片機)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，BX53型生物顯微鏡)；HITACHI電鏡(日本日立高新技術公司，HT7700-SS/FEI Tecnai G20 TWIN)；自制大鼠鼠衣及懸掛大鼠裝置。

1.3 動物分組及造模

將30只SD大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、電針組各10只。模型組及電針組大鼠參考多因素干預法[8]并加以適當改良，制備FD肝郁脾虛模型。

①冰生理鹽水灌胃：配制0.9% NaCL溶液，置于冰箱中冰凍至-4 ℃，灌胃每次2 mL，每日1次；②夾尾法刺激：用長尾夾包裹紗布以免損傷大鼠尾部，夾在大鼠尾部后2/3處,以不破皮為度,令其暴怒并激怒全籠大鼠，表現為大鼠均站立，雙上肢打斗，每天1次(刺激間隔不少于6 h)，每次30 min；③隔日禁食，飲水正常。以上三法按順序同時實施，造模20 d。每日21時稱大鼠體質量并登記，且所有大鼠每日食物等重量。

造模成功標志：大鼠體質量進行性減輕；活躍程度從時?；\中自發打斗至喜成堆蜷縮，敲打籠子仍不動彈，抓捕反應遲鈍；情緒由稍有聲響就易怒煩躁轉變為持續噪音刺激或是喂食仍無特別反應，情緒異常低落；鼠毛從白凈順滑至凌亂、倒張、發黃；大鼠糞便從深棕色、干燥、質硬、無臭、長條圓柱狀進展成棕黃色、濕潤、質軟、微臭、短條圓柱狀，最后成為黃綠色稀便，可見未消化的顆粒飼料且奇臭。經模型評價，模型組及電針組20只大鼠造模均成功，在造模期間空白組大鼠給予安靜環境隔離，不予任何處置。

1.4 電針刺激

造模結束后第2天開始對電針組進行電針干預。給電針組大鼠穿上定制鼠衣后懸掛于自制懸掛架上。參照《實驗針灸學》[9]取大鼠“后三里”穴及“太沖”穴，酒精局部消毒后，采用0.35×25 mm(1寸)毫針分別直刺深度約12.5 mm(約0.5寸)、5 mm(約0.2寸)。將雙側“后三里”穴接韓氏穴位神經刺激儀，連續波，頻率2 Hz，強度1 mA，雙側“太沖”穴靜留針。每次治療時間30 min，每日治療1次(9AM～11AM)，治療14 d?？瞻捉M和模型組在治療期間給予電針組同樣的穿鼠衣及懸吊，不予其他任何處置，在安靜環境隔離。在電針組最后1次治療結束，將各組大鼠稱重并禁食24 h后取材。

1.5 免疫印跡法檢測十二指腸ZO-1、Occludin蛋白表達

取少量十二指腸粉碎組織加入0.3 mL裂解液勻漿后裂解，隨后于4 ℃下12000rpm離心5 min，取上清液。提取總蛋白之后用DG-3022 A酶標儀測定蛋白濃度，隨后將提取的蛋白上清與5ⅹ蛋白上樣緩沖液進行沸水浴中10 min，使蛋白變性。配置5%濃縮膠、12%分離膠后開始電泳、轉模、免疫印跡顯色等步驟檢測后得到灰度條帶，采用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行測定。

1.6 透射電鏡觀察十二指腸機械屏障

取1 cm2十二指腸組織塊迅速置于2.5%的戊二醛固定液中，并于4 ℃固定4 h，隨后移除固定液，用PBS漂洗3次，每次15 min。用1%的鋨酸和PBS室溫(20 ℃)固定2 h后再次用PBS漂洗3次，每次15 min。按乙醇梯度(50%-70%-80%-90%-95%-100%)上行脫水，每次15 min。采用丙酮滲透過夜后60 ℃聚合48 h，隨后切成60 nm超薄片。鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)切片，室溫干燥過夜后用日本HITACHI公司電鏡觀察。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達比較

圖1示，與空白對照組比較，模型組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達明顯增高(P<0.05)。

注：與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05圖1 各組大鼠十二指腸ZO-1、Occludin表達情況

2.2 透射電鏡下觀察

正常組大鼠十二指腸上皮細胞排列整齊，細胞膜完整，細胞間隙正常(見圖2A)。模型組電鏡下見十二指腸上皮細胞間隙增寬，緊密連接模糊，絨毛排列雜亂，線粒體腫脹(見圖2B)。電針組電鏡下見十二指腸上皮細胞間隙較清晰，未見增寬且絨毛排列整齊(見圖2C)。

注：緊密連接：黑色箭頭；BL:bowel lumen，十二指腸腸腔側圖2 各組大鼠十二指腸黏膜超微結構比較

3 討論

FD嚴重影響患者的生活質量，增加了社會醫療負擔[10]。在發達國家，約有12%～15%的FD患者，且有逐年升高的趨勢[12]。目前FD的治療方式主要是西藥(促動力劑、抑酸劑、抗幽門螺桿菌劑等)，因西藥療效欠佳，無法適應復雜的個體差異，中醫療法逐漸被人們認可[12]。中醫療法中，電針治療FD療效滿意[13-18]。本研究采用夾尾刺激等復合因素造模，使得大鼠暴怒，怒傷肝，肝木克傷脾土，損脾氣，久則陽邪轉為陰邪，形成肝郁脾虛證，模型評價可證實。足三里穴為胃經合穴，可健脾益氣；太沖穴為足厥陰肝經原穴，可疏肝理氣、和胃降逆。本證涉及肝脾，此兩穴合用共奏健脾疏肝之效。

緊密連接蛋白(tight junction,TJ)是參與調節黏膜機械屏障的重要成分之一，其通過調控內皮及上皮細胞旁通透性發揮作用[19]。緊密連接蛋白由維持細胞間屏障的跨膜蛋白及調控緊密連接蛋白定位的細胞質支架蛋白組成[20]，ZO-1、Occludin為跨膜蛋白。Occludin可調節黏膜屏障及細胞間通透性，是第一個被確認的緊密連接跨膜蛋白。ZO-1表達在細胞之間，其定位對維持TJ的功能至關重要。ZO-1還可發揮胞內支架蛋白的作用，將Occludin固定于細胞骨架從而調節緊密蛋白完整性[21]。有研究表明[6]，黏膜通透性增加的主要原因是緊密連接蛋白表達降低，因此ZO-1和Occludin是參與調節黏膜機械屏障的重要蛋白。

本研究結果表明，模型組大鼠ZO-1、Occludin蛋白表達水平顯著降低，且細胞緊密連接增寬、模糊，絨毛排列雜亂，提示FD的發病機制與十二指腸黏膜機械屏障有關。經治療后，電針組大鼠ZO-1、Occludin蛋白表達水平較模型組升高，且細胞連接及絨毛接近正常，提示電針可能通過調節ZO-1、Occludin蛋白表達水平，恢復十二指腸黏膜機械屏障來治療FD。黏膜屏障包括化學屏障、機械屏障及免疫屏障。本研究僅就緊密連接蛋白及細胞間緊密連接超微結構，反映了機械屏障方面，擬進一步從化學屏障及免疫屏障角度全面深入探究腸黏膜屏障與FD發病機制關系和電針治療FD的作用機制。