壯通飲對心肌缺血再灌注后心律失常影響的實驗研究

黃小珊 藍凰齊 唐漢慶 張世田 龐路路

摘 要 目的：觀察壯通飲水提物對心肌缺血再灌注模型大鼠血液流變學和血脂水平的影響，初步探討該方減少缺血再灌注后心律失常發生的分子生物學基礎。方法：取SD大鼠75只，隨機分為對照組、模型組和壯通飲水提物低、中、高劑量組（6.8、13.6、27.2 g/kg），每組15只。通過結扎左心室回旋支末梢致缺血30 min和再灌注60 min，建立大鼠心肌缺血再灌注模型。術后第1天起，對照組、模型組大鼠均灌胃等體積水，壯通飲水提物各劑量組大鼠灌胃相應藥液，每日1次，連續28 d。分別在術后第7、14、21、28天檢測大鼠心律失常發生情況并計算發生率。給藥結束后，檢測大鼠血液流變學指標和血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量;采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠心肌組織形態學;采用Western blotting法檢測大鼠心肌組織中凋亡相關因子FAS和FAS配體（FAS-L）的蛋白表達。結果：與對照組比較，模型組大鼠心律失常發生率顯著升高，全血比黏度、血細胞比容（HCT）、體外形成血栓長度和質量、血小板凝聚率、紅細胞濾過指數（IF）以及血清TC、TG、LDL-C含量均顯著增加或升高，體內血栓的形成時間顯著縮短，血清HDL-C含量顯著降低，心肌組織中FAS和FAS-L蛋白相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;大鼠心肌組織形態學呈明顯病理改變。與模型組比較，壯通飲水提物各劑量組大鼠心律失常發生率呈明顯下降趨勢;除壯通飲水提物低劑量組大鼠的HCT降低不具有統計學意義（P>0.05）外，其余給藥組大鼠的全血比黏度、HCT、體外形成血栓的長度和質量、血小板凝聚率、IF值以及血清TC、TG、LDL-C含量均顯著減少或降低，體內血栓的形成時間均顯著延長，血清HDL-C含量均顯著升高，心肌細胞中FAS和FAS-L蛋白相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;大鼠心肌組織病理變化明顯改善。結論：壯通飲可通過其活血化瘀作用改善心肌缺血再灌注模型大鼠的血液流變學指標，降低血清中TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量，并下調FAS和FAS-L蛋白表達，從而發揮抑制心肌細胞凋亡的作用，減少心律失常的發生。

關鍵詞 壯通飲;心肌缺血再灌注;血液流變學;血脂;凋亡相關因子;冠心病;心律失常;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Zhuangtongyin water extract （ZTYWE） on hemorheology and blood lipid level of myocardial ischemia-reperfusion model rats， and preliminarily explore its molecular biology foundation of reducing arrhythmia after myocardial ischemia-reperfusion. METHODS： Totally 75 SD rats were divided into control group， model group and ZTYWE low-dose， middle-dose and high-dose groups. Myocardial ischemia-reperfusion model was established by ligating the left ventricle cyclotron endings for 30 min then reperfusing for 60 min. Since the first day after surgery， control group and model group were intraperitoneally administrated with same volume normal saline; ZTYWE low-dose， middle-dose and high-dose groups were intraperitoneally administrated with medicine solution （6.8， 13.6， 27.2 g/kg）， once a day， for continuous 28 d. At the 7th， 14th， 21st， 28th day after surgery， the incidence rate of arrhythmia of rats were detected. The hemorheology indicators and serum contents of TC， TG， LDL-C， HDL-C were determined after the last administration. The morphology of myocardial tissue was observed by HE staining. The protein expressions of apoptosis-related factor FAS and FAS-L were detected by Western blotting assay. RESULTS： Compared with control group， the incidence rates of arrhythmia of rats in model group were significantly increased; the whole blood contrast viscosity， hematocrit （HCT）， in vitro forming length and quality of thrombosis， platelet aggregation rate， erythrocyte filtration index （IF）， as well as the serum contents of TC， TG and LDL-C were significantly increased; in vivo thrombus formation time as well as the serum content of HDL-C were significantly decreased; the protein expression of FAS and FAS-L were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）; obvious pathological changes were observed in myocardial tissue. Compared with model group， the incidence rates of arrhythmia of rats in ZTYWE groups were in obvious reducing trend; except for the HCT in low-dose ZTYWE group without significance， the blood contrast viscosity， HCT， in vitro forming length and quality of thrombosis， platelet aggregation rate， IF as well as the serum contents of TC， TG and LDL-C were significantly decreased; in vivo thrombus formation time as well as the serum contents of HDL-C were significantly increased; the protein expressions of FAS and FAS-L were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）; the pathological changes of myocardial tissue were improved. CONCLUSIONS： Through the promoting blood circulation and removing blood stasis effect， Zhuangtongyin decoction can improve indexes of hemorheology index of ischemia-reperfusion model rats， reduce the contents of TC， TG and LDL-C， enhace the contents of HDL-C， down-regulate the protein expression of FAS and FAS-L， so as to inhibit myocardial cells apoptosis and reduce arrhythmia.

KEYWORDS? ?Zhuangtongyin decoction; Myocardial ischemia-reperfusion; Hemorheology; Blood lipid; Apoptosis-related factor; Coronary heart disease;Arrhythmia; Rats

冠狀動脈梗塞后會發生心肌缺血，而恢復血液灌流后卻發現會繼發系列損傷，即心肌缺血再灌注損傷（如心律失常等），而心律失常是導致患者死亡的常見原因[1]。冠狀動脈粥樣硬化是冠狀動脈梗塞的主要原因，研究表明，高脂血癥是冠狀動脈粥樣硬化的危險因素，降脂治療可以顯著降低冠狀動脈粥樣硬化的風險[2]。此外，由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔變窄、血流量減少、血流變慢而使血液處于高凝狀態、流動性變差，故存在形成微血栓、加重心律失常發生的危險[3]。因此，防止冠狀動脈粥樣硬化并使血液流變學參數恢復正常從而減少再灌注后心律失常，對于冠心病的治療具有重要的臨床意義。

壯通飲是廣西壯族民間常用的經驗方，由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮等3味廣西特色壯藥材配伍而成，具有活血化瘀之效[4]。該方臨床用于治療高脂血癥、腦梗死、心肌梗死等心腦血管疾病具有較好的效果[5-7]，但針對其通過活血化瘀作用治療心腦血管疾病方面的分子生物學機制研究尚不多見。為此，本課題組基于前期研究，通過建立心肌缺血再灌注大鼠模型，觀察壯通飲水提物對模型大鼠血液流變學和脂質代謝的影響，并初步探討其通過活血化瘀作用減少冠心病心律失常發生的分子生物學基礎，為其臨床應用提供實驗基礎，進而推動壯族醫藥經驗方的開發與應用。

1 材料

1.1 儀器

MR-4型微電腦血栓檢測儀（鄭州綠康科技生物發展有限公司）;ZS9200型血流變測試儀（北京眾馳偉業科技發展有限公司）;V-100型小動物呼吸機（上海玉研科學儀器有限公司）;AU-2700型全自動生化分析儀、IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;AE160型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;077526型心電圖機（上海光電醫用電子儀器有限公司）;PowerPac HC型電泳儀（美國Bio Rad公司）;RM2245型切片機（上海萊卡顯微系統有限公司）;PK121R型離心機（美國ALC公司）;1500M型生物醫學凝膠成像系統（美國DVC公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：D0801320，規格：80萬單位/瓶）;總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180235、20180225、20180236、20180237）;凋亡相關因子FAS和FAS配體（FAS-L）Western blotting蛋白表達檢測試劑盒、蛋白裂解液、β-actin（內參，北京索萊寶科技有限公司，批號：20180420、20180422、2181466、2180892）;蘇木精、伊紅染色試劑（上海藍季科技發展有限公司，批號：A10034、A10022）;0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號：H20056626;作生理鹽水使用）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

扶芳藤飲片（廣西仁濟堂中藥飲片有限公司，批號：151101）;參三七飲片（江西樟樹天齊堂有限公司，批號：20131023）;黃花倒水蓮飲片（廣西張益堂中藥飲片有限公司，批號：1602092）。上述藥材飲片經右江民族醫學院基礎醫學院李克明副教授鑒定分別為衛矛科植物扶芳藤[Euongmus fortunei（Turez）Hand-Mazz]的莖葉、五加科植物參三七[Panax notoginseng （Burk）F. H. Chen]的干燥根、遠志科植物黃花倒水蓮[Polygala aureocauda Dunn]的根。

1.4 動物

SPF級SD大鼠75只，雌雄各半，9～10周齡，體質量180～205 g，由右江民族醫學院實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK桂2017-0004。所有大鼠均分籠常規飼養。

2 方法

2.1 壯通飲水提物的制備

取扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮飲片，粉碎，過50目篩，按質量比6 ∶ 3 ∶ 4混合，用10倍量水（g/mL）煎煮，濾過，濾液置于水浴鍋中蒸干，得壯通飲水提物浸膏（每100克藥材得浸膏60 g）。臨用前，取水提物浸膏，以水溶解，制得質量濃度為2.72 g/mL（按浸膏質量計）的溶液，備用。

2.2 動物分組、造模與給藥

取大鼠75只，按隨機數字表法分為對照組、模型組和壯通飲水提物低、中、高劑量組，每組15只。參考本課題組前期研究結果[4]造模：除對照組不作任何處理外，其余組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，使用小動物呼吸機機械通氣并行心電監護;經左側開胸，暴露心臟，結扎左心室回旋支末梢，直至觀察到結扎下方心肌顏色逐漸變灰白（缺血區）及心電圖出現S-T段抬高0.2 mm或者出現增高、增寬的QRS波后，用生理鹽水浸濕的紗布覆蓋于傷口處;缺血30 min后剪開結扎線，觀察直至心臟顏色由灰白逐漸變成正常、心電圖S-T段下降，則視為再灌注開始;再灌注60 min后，縫合切口，置于籠中飼養。于所有大鼠的大腿處肌內注射青霉素鈉80萬單位（每日1次，連續3 d）以預防感染。術后第1天起，對照組、模型組大鼠均灌胃等體積水，壯通飲水提物低、中、高劑量組大鼠分別按體質量以6.8、13.6、27.2 g/kg（以浸膏質量計，劑量參考文獻[8]設置）灌胃給藥，每日1次，連續28 d。

2.3 大鼠心律失常情況觀察

分別在術后第7、14、21、28天時使用心電圖機記錄大鼠心律失常發生情況，并計算發生率。

2.4 大鼠血液流變學指標檢測

于末次給藥后4 h開始，分離大鼠頸動脈并放置刺激電極和記錄電極，采用血栓檢測儀測定體內血栓的形成時間;測定完畢后，于其腹主動脈采血，采用血流變測試儀測定其全血比黏度（低切變率、高低變率）、血細胞比容（HCT）、體內血栓形成時間、體外形成血栓長度和質量、血小板聚集率、紅細胞濾過指數（IF）。

2.5 大鼠血清血脂指標含量檢測

按“2.4”項下時間點于大鼠腹主動脈采血，以4 000 r/min離心10 min后取血清。采用全自動生化分析儀以分光光度法檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。嚴格按相應試劑盒說明書操作。

2.6 大鼠心肌組織形態學變化觀察

按“2.4”項下時間點于大鼠腹主動脈采血后，取大鼠左心室心尖部分組織，以生理鹽水洗凈，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h;常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度5 μm），常規脫蠟復水后，進行蘇木精-伊紅（HE）染色;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察心肌組織形態學變化并拍照。

2.7 大鼠心肌組織中FAS和FAS-L蛋白相對表達量檢測

采用Western blotting 法進行檢測。按“2.6”項下時間點取大鼠左心室心尖部分組織，加入5倍體積（g/mL）的裂解液冰浴裂解30 min;4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上清液，經蛋白定量、變性、聚丙烯酰氨凝膠電泳、轉膜、封閉后加入FAS、FAS-L、β-actin一抗（1 ∶ 600），4 ℃孵育過夜;再加入二抗（1 ∶ 2 000），室溫下孵育1 h，增強化學發光法顯影;采用凝膠系統拍攝圖像。采用Image J 1.48圖像分析軟件分析所得蛋白條帶的灰度值（條帶面積×條帶密度），并以β-actin 為內參對照，計算各目標蛋白灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，用以表示目標蛋白的相對表達量。

2.8 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以率（%）表示，兩組間比較采用卡方檢驗。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析;對差異有統計學意義的再采用Bartlett檢驗進行兩組間方差齊性檢驗，若方差齊則采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較，若方差不齊則采用非參數秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠心律失常情況

與對照組比較，模型組大鼠術后第7、14、21、28天時心律失常發生率均顯著升高，分別為87%、87%、80%、73%（P<0.01）。與模型組比較，壯通飲水提物中、高劑量組大鼠在術后第14、21、28天時心律失常發生率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.2 大鼠血液流變學指標檢測結果

3.2.1 全血比黏度和HCT 與對照組比較，模型組大鼠全血比黏度、HCT均顯著升高（P<0.01或P<0.05）。與模型組比較，除壯通飲水提物低劑量組大鼠HCT的降低不具有統計學意義外（P>0.05），壯通飲水提物其余各劑量組的上述指標均顯著降低（P<0.01或P<0.05），且與對照組指標水平較為接近，詳見表2。

3.2.2 其他血液流變學指標 與對照組比較，模型組大鼠體內血栓的形成時間顯著縮短，體外形成血栓長度和質量、血小板凝聚率、IF值均顯著增加或升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，壯通飲水提物各劑量組大鼠體內血栓的形成時間均顯著延長，而體外形成血栓長度和質量、血小板凝聚率、IF值均顯著減少或降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.3 大鼠血清血脂指標檢測結果

與對照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均顯著升高，HDL-C含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，壯通飲水提物各劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均顯著降低，HDL-C含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.4 大鼠心肌組織形態學變化

對照組大鼠心肌纖維境界清楚、排列規則、輪廓分明、染色均勻，未見滲液或炎癥細胞浸潤;模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、境界不清有斷裂、染色深淺不均，局部有溶解壞死現象;與模型組比較，壯通飲水提物各劑量組大鼠心肌纖維排列紊亂、溶解壞死等現象均有不同程度的減輕，詳見圖1。

3.5 大鼠心肌組織中FAS和FAS-L蛋白相對表達量檢測結果

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中FAS和FAS-L蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，壯通飲水提物各劑量組大鼠心肌組織中上述蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表5。

4 討論

心肌缺血再灌注后會出現心肌細胞凋亡、微動脈損傷及心律失常等系列損傷，其中心律失常較為常見，且為患者主要致死原因之一[9]，因此有必要對再灌注后心律失常的發生機制進行更深入的研究。對于心肌缺血再灌注后心律失常的發生，有報道認為與高脂血癥密切相關[10]。高脂血癥可誘導心肌重構和心律失常，而通過藥物干預降低血脂水平、減少心肌細胞凋亡和心肌重構從而抑制心律失常的發生是治療心肌缺血再灌注后心律失常的有效途徑[11]。還有研究表明，高脂血癥可導致心肌細胞凋亡、加重心肌缺血再灌注損傷[12];高脂飲食誘導的心肌細胞過度凋亡易引起心律失常[13]，而通過降低血脂水平、減輕血液高黏狀態、下調凋亡相關因子FAS和FAS-L表達水平可減緩心肌細胞凋亡并減少心律失常的發生[14-15]。

血清中LDL-C、HDL-C、TC、TG含量是主要的血脂水平指標。研究證實，LDL-C含量越高，脂類沉淀速度越快，泡沫細胞形成越多，越容易誘發動脈硬化，導致心肌缺血[16];TC、TG有促進動脈粥樣硬化發生的作用[17-18]，而HDL-C具有抗動脈粥樣硬化的作用[19]。因此，降脂治療已成為抗動脈粥樣硬化、減少心肌缺血及心肌缺血再灌注后心律失常發生的重要方法。另一方面，動脈粥樣硬化使管腔變得狹窄、血流量減少、血流緩慢、血液處于高凝狀態，而具有活血化瘀功效的中藥可通過改善冠心病血液高黏度及高凝聚病理狀態，從而恢復血液正常生理特性以及降低血脂水平[3]。

本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌缺血再灌注后心律失常的發生率顯著升高，但隨時間的延長呈降低趨勢，推測可能是部分大鼠機體自身存在的調節機制反應比較靈敏，從而能不同程度地消除心律失常影響所致。采用壯通飲水提物對心肌缺血再灌注模型大鼠進行干預后，中、低劑量組大鼠心律失常發生率（術后第14、21、28天）呈明顯下降趨勢;除壯通飲水提物低劑量組大鼠的HCT降低不具有統計學意義外，其余各劑量組的全血比黏度、HCT、體外形成血栓的長度和質量、血小板凝聚率、IF值均顯著減少或降低，體內血栓的形成時間均顯著延長;血清TC、TG、LDL-C含量均顯著降低，而HDL-C含量顯著升高;心肌組織形態學觀察結果顯示，其心肌纖維病理變化得到明顯改善。FAS和FAS-L是介導細胞凋亡的重要因子，兩者蛋白表達的上調可早期啟動凋亡進程并誘導下游凋亡蛋白活化，從而促進細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，采用壯通飲水提物對心肌缺血再灌注模型大鼠進行干預后，大鼠心肌組織中的FAS和FAS-L蛋白表達水平均顯著降低。這提示壯通飲一方面可改善血液“黏、濃、凝、聚”的病理變化，表現出“活血”作用;另一方面可降低血脂水平，表現出“化瘀”作用，進而發揮減少細胞凋亡和心律失常發生的作用。

綜上，壯通飲水提物能明顯減少心肌缺血再灌注模型大鼠的心律失常情況;該方可通過其活血化瘀作用改善大鼠血液流變學指標，降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，提高HDL-C含量，并下調FAS和FAS-L蛋白表達，從而發揮抑制心肌細胞凋亡的作用。

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（收稿日期：2019-07-24 修回日期：2019-12-29）

（編輯：段思怡）