丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉通過調控高遷移率組蛋白1減輕內毒素導致的大鼠急性肺損傷

劉濤 劉偉欣 賀明 楊玉姣 吳珍 胡旭光

1廣東藥科大學（廣州510006）；2 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司（廣州510515）；3 廣東藥科大學附屬第二醫院（廣州新海醫院）（廣州510300）

在膿毒癥發病過程中，有將近50%的患者會出現急性肺損傷的癥狀，該并發癥是導致膿毒癥患者死亡的主要原因之一[1-2]。臨床上，對于膿毒癥伴隨急性肺損傷的治療手段有限，因此，發展新型的治療方法及治療藥物對該病的治療極為重要。

高遷移率組蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種極為保守的，廣泛存在于細胞內的一種類組蛋白[3]。研究[4-8]發現，在炎癥情況下，被免疫細胞分泌至細胞外的HMGB1是一種晚期致死性炎癥因子，會反向促進更多的炎癥因子分泌，誘導機體產生嚴重的炎癥反應。HMGB1 特異性的抗體和HMGB1 受體抑制劑的使用相繼被證明可以有效緩解急性炎癥反應[9]。在相應的藥物治療開發方面，中醫藥的是一個巨大的寶庫，中藥抗炎治療將會是臨床上一項重要的方法。本研究即對中藥丹參的提取物丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉的抗炎效果進行了研究。

丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉有諸多的功能，如降低心肌梗死范圍，減少氧自由基，提高心肌耐缺氧能力等[10-13]。然而，多數的研究都集中于丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對于心臟疾病，血液疾病的效果上，對于炎癥反應的治療卻少有提及，僅有部分研究表明它對于急性肺纖維化有較好的療效。因此，本研究從膿毒癥所致急性肺損傷著手，觀察丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對于急性炎癥的療效，為臨床治療急性炎癥提供一種新的備選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料脂多糖（LPS）（貨號：L2880），地塞米松（貨號：D4902）從美國Sigma公司購得，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液（國藥準字H31022558），從廣東省中醫院購得。

1.2 動物SD 大鼠，雄性，體質量180～220 g，南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（粵）2017-0021。所有動物都飼養在溫度22℃和濕度55%的環境中，飲水與食物充足供應。本次動物實驗符合動物倫理委員會的要求。

1.3 動物實驗

1.3.1 病死率觀察將大鼠隨機分為正常組（Control 組），模型組（LPS 組），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉低劑量組（LD 組），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉高劑量組（HD組）及陽性對照組（地塞米松，Positive Control）各10只。Control 組腹腔注射生理鹽水，其余各組均腹腔注射LPS（15 mg/kg），之后，LD 組和HD 組分別給予丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉腹腔注射8 mg/kg和16 mg/kg，陽性對照組給予地塞米松（1 mg/kg）腹腔注射，分別在6、12、24、48和72 h 這5個時間點觀察大鼠的死亡數量，以此來推測丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉的療效。

1.3.2 血清及肺組織提取50只SD 雄性大鼠，分組及治療同上。藥物注射24 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，腹主動脈采血5 mL，離心后取上清，-80℃凍存（Elisa 備用）。取大鼠右側肺組織，切塊后一半甲醛固定（病理切片備用），另一半-80℃凍存（Western Blot及qPCR 備用）

1.4 病理切片制備經甲醛固定的肺組織經常規石蠟包埋后切成3 μm的薄片，利用二甲苯及不同濃度的酒精和水進行脫蠟，采用蘇木精和伊紅進行染色，染色后的切片經純酒精脫水，再經二甲苯使切片透明，封片后采用顯微鏡進行拍照，通過對圖片進行評分觀察其病理狀態的改變[14]。

1.5 酶聯免疫吸附測定（Elisa）血清中HMGB1、血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）的濃度均采用Elisa 試劑盒（英杰公司，美國）進行測定。將100 μL的血清加入包被有上述蛋白抗體的微孔中，室溫孵育1 h后清洗3 遍，加入辣根過氧化物酶偶聯的抗體并孵育1 h，清洗后加入TMP 基質，室溫孵育1 h后加入終止液，采用450 nm 波長的光測定其吸光值。

1.6 蛋白免疫印記分析（Western Blot）肺組織研磨后加入RIPA 裂解液（賽默飛，貨號：89900）和蛋白酶抑制劑（賽默飛，貨號：78425B）的混合液（100∶1）。12 500轉離心15 min后，取上清即得肺組織的總蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行跑膠分離蛋白，轉印至PVDF 膜，7%牛奶封閉后，采用anti-HMGB1（1∶1 000，貨號ab79823，Abcam），Anti-TNF-α（1∶1 000，貨號：ab1793，Abcam），anti-β-actin（1∶1 000，貨號：ab8226，Abcam），Anti-IL-1β（1∶1 000，貨號：YT5201，ImmunoWay）進行孵育，4℃過夜。回收一抗后，用偶聯辣根過氧化物酶的抗IgG 抗體進行孵育1 h，采用化學發光法進行檢測。

1.7 定量聚合酶鏈反應（qPCR）取肺組織，研磨后利用trizol 提取方法提取RNA，按照TaKaRa 逆轉錄試劑盒的操作說明對各組的RNA進行逆轉錄，條件如表1所示。然后進行Real Time PCR 反應，引物如表2所示，PCR 反應條件如表3所示。

表1 逆轉錄反應體系Tab.1 Reverse transcription reaction system

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

表3 Real Time PCR 反應體系Tab.3 Real time PCR reaction system

1.8 統計學方法采用SPSS 21.0進行統計學分析，圖片采用Graphpad Prism 5.0進行制作。數據采用均數±標準差進行表示，組間比較采用方差分析進行比較，存活率采用Kaplan-Meier 方法進行分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉提高LPS 誘導的急性肺損傷大鼠的存活率動物的生存情況是判斷藥物是否有效的重要標準，如圖1所示，使用LPS 刺激后的大鼠在72 h內有80%的病死率（P＜0.001），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后，有效提升了大鼠的存活率，其中LD 組與陽性對照組更加接近。

圖1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉提高LPS 誘導的急性肺損傷大鼠的存活率Fig.1 Tanshinone IIA sodium sulfonate improves the survival rate of lps-induced acute lung injury in rats

2.2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導的急性肺損傷的病理損傷經LPS 刺激后，大鼠肺組織出現了典型的炎癥病理反應，如肺泡間隔增厚，出血，水腫及炎性細胞浸潤。而丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉組及陽性對照組的相關癥狀均被有效緩解（圖2A）。經LPS 刺激后，LPS 組肺組織的病理學評分也顯著高于Control 組，而丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉組及陽性對照組也顯著低于LPS 組（圖2B，表4），說明丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對急性肺損傷的有效性。

2.3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低膿毒癥大鼠血清炎性因子的分泌水平LPS 刺激導致大鼠血清中炎性因子HMGB1，TNF-α和IL-1β的水平顯著增高（P＜0.05），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可有效降低血清中炎性因子的分泌水平，與陽性對照藥物地塞米松效果相似（圖3，表5）。

2.4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低肺組織中HMGB1和NF-κB的水平LPS 刺激誘導肺組織中HMGB1及NF-κB P65的蛋白表達水平及mRNA 轉錄水平顯著升高（圖4D、4E，P＜0.05），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉有效抑制了HMGB1和NF-κB P65的轉錄，并且降低了組織中的蛋白表達水平（圖4A～C，P＜0.05）。

3 討論

急性肺損傷是一種常見的膿毒癥并發癥，該損傷主要是由于急性的炎癥反應所導致的。在臨床上，雖然已經有一些治療方案用于針對急性肺損傷，然而該病的預后仍不容樂觀。鑒于此，研究者針對該病也制作出了不同的動物模型，用于深一步的研究[15-16]。本次研究使用了最常用的LPS誘導來建立膿毒癥伴隨急性肺損傷的模型，用于探究丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對于急性肺損傷的療效。因地塞米松可抑制炎癥細胞的集聚，并抑制炎癥化學中介物的合成和釋放，故本研究使用地塞米松作為陽性對照藥物。研究結果顯示，丹皮酚可以有效提高膿毒癥伴隨急性肺損傷大鼠的存活率，同時，降低因LPS 刺激所導致的肺組織充血，水腫，炎性細胞浸潤以及炎性因子的分泌。這些結果都表明丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可作為臨床治療急性肺損傷的另一種備選方案。

圖2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導的急性肺損傷的病理損傷Fig.2 Tanshinone IIA sodium sulfonate improves the pathological damage of LPS induced acute lung injury

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導的急性肺損傷的病理損傷評分表Fig.4 Therapeutic effect of tanshinone Ⅱ-a sulfonate on LPS induced acute lung injury±s

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導的急性肺損傷的病理損傷評分表Fig.4 Therapeutic effect of tanshinone Ⅱ-a sulfonate on LPS induced acute lung injury±s

組別例數評分Control 組10 1.3±0.13 LPS 組5 5.5±0.15 LD 組7 2.5±0.11 HD 組8 0.4±0.09陽性對照組8 2.2±0.11

圖3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低毒癥大鼠血清中炎性因子的分泌水平Fig.3 Tanshinone IIA sodium sulfonate reduces the level of inflammatory factors in serum of virulent rats

表5 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低毒癥大鼠血清中炎性因子的分泌水平Tab.5 Tanshinone Ⅱ-a sulfonate reduces the secretion of inflammatory factors in serum of toxic rats ±s

表5 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低毒癥大鼠血清中炎性因子的分泌水平Tab.5 Tanshinone Ⅱ-a sulfonate reduces the secretion of inflammatory factors in serum of toxic rats ±s

組別例數HMGB1 IL-1β TNF-α Control 組10 237±6.89 367±16.05 154±6.87 LPS 組5 1 561±117.8 1 925±92.47 834±67.64 LD 組7 398±55.19 705±64.99 315±13.21 HD 組8 498±52.55 592±51.68 350±19.61陽性對照組8 435±52.31 561±33.46 239±14.62

圖4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低肺組織中HMGB1和NF-κB的水平Fig.4 Tanshinone IIA sodium sulfonate decrease the level of HMGB1 and NF-kappa B in lung tissue

HMGB1在正常情況下多集中于細胞核內，一旦受到LPS的刺激，即會轉運出核并分泌至細胞外，細胞外的HMGB1 則會成為一個致死性的炎癥因子。因此，血清中HMGB1的含量對于炎癥嚴重程度是一個重要的影響[17-19]。HMGB1的提高會導致其受體RAGE 也隨之升高，進而激活其下游包括NF-κB在內的炎癥相關通路[20]。因此，對于急性肺損傷的患者，抑制HMGB1的過度表達及分泌或者其下游的炎癥通路至關重要。目前，應用HMGB1的抗體及抑制劑可降低血清中HMGB1的含量，并提高膿毒癥休克小鼠的生存率。本次研究結果表明，LPS 刺激后可顯著提升大鼠肺組織中HMGB1的分泌量，而丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可降低炎性肺損傷大鼠肺部HMGB1的分泌，這可能是其發揮抗炎功效的關鍵點。

NF-κB 介導的炎癥反應是膿毒癥反應中重要的一部分。抑制狀態下的NF-κB 主要存在于細胞質內并和其抑制物IκBα 相結合。在炎癥反應中，IκBα 會被降解，NF-κB 則會轉運至細胞核內，促進多種炎癥因子（如細胞因子，趨化因子，黏附因子）的轉錄[21-22]。本次研究也表明了丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可抑制NF-κB的表達，并抑制在LPS 刺激下其下游的TNF-α和IL-1β的表達。

本次研究表明，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉通過抑制HMGB1的表達和分泌，降低NF-κB的激活并抑制炎性因子的分泌來提高LPS 刺激的膿毒癥伴急性肺損傷大鼠的存活率。低劑量和高劑量的丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對炎癥反應的緩解能力并無差異，最佳用藥劑量仍需進一步探討。另外，本次研究雖證明了丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對大鼠急性肺損傷是通過抑制HMGB1和NF-κB 來實現的，但仍缺乏有力的反向驗證，同時，HMGB1和NF-κB在細胞內的定位很大程度上決定了其功能，而其定位則主要受到其本身的乙酰化和磷酸化修飾的影響，這兩者都是本項目下一步研究的重點方向。