運用乙醇滲漉法優化三葉魚藤中魚藤酮提取工藝
——基于響應面法

郭 霞， 黃丹慜， 茍志輝， 田 蜜

(海南省林業科學研究所， 海口 571100)

三葉魚藤(Derristrifoliata)屬豆科(Leguminosae)魚藤屬(Derris)多年生藤本植物[1-2]，產于熱帶和亞熱帶地區，在我國海南、廣西、廣州、臺灣等紅樹林生長地廣泛分布.該植物富含黃酮類物質，尤其以魚藤酮最為特殊[3-4].該物質有毒，民間最早用作殺魚劑[5].后來發現魚藤酮的殺蟲活性，在農業生產中得到實際應用[6-8].近來，在醫藥方面研究發現，魚藤酮對帕金森病有一定的預防和治療作用[9-10].目前有大量文獻和專利報道提取魚藤屬中的魚藤酮.使用的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、苯、氯仿等[11-12].其中丙酮和氯仿為管制溶劑，苯的毒性較大，這些溶劑危險性較高，環境風險較大，越來越不適合實驗室和工業生產使用.甲醇沸點低、正丁醇沸點太高，為此，本研究選擇乙醇為提取溶劑.提取方法有加熱提取法[12]、微波提取法[13]、超臨界CO2萃取法[14-17]等.2016年9月18日，海南對東寨港國家級自然保護區管理局三葉魚藤種群進行招標防控；2016年10月26日，海南日報以“魚藤瘋長，紅樹林告急”為題，報道了儋州新英灣紅樹林生態系統受三葉魚藤的威脅，需要引起足夠重視，導致三葉魚藤成為有害生物[18].因此，為了變廢為寶，充分挖掘三葉魚藤的價值，提取其中魚藤酮活性物質.本實驗采用滲漉法常溫提取，避免浪費熱能，安全系數較高.同時選擇乙醇濃度和提取時間，采用響應面法優化提取魚藤酮，為工業生產服務.

1 材料與方法

1.1 供試材料

三葉魚藤(DerristrifoliateLour.)根莖采自海口東寨港國家級自然保護區(110°34′E，19°51′N)，海南東寨港國家級自然保護區位于海南省東北部，屬熱帶季風區海洋性氣候，土壤有機質含量豐富，pH值在3.5～7.5之間.采樣區內平均海拔為2 m，主要為海蓮、桐花樹、角果木、秋茄等植物群落.三葉魚藤根莖采摘之后切成1 cm片段，晾干、粉碎，過60目篩，備用.

1.2 單因素試驗

采用室溫(25 ℃)滲漉法提取[19]，溶劑選擇乙醇，濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%，提取時間為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d，過濾，溶液進行減壓濃縮，真空減壓干燥，得到粗提物樣品，備用.

1.3 魚藤酮含量測定

以魚藤酮標準樣品(Sigma公司，含量99%)為參照(圖1)，采用美國Agilent 6890N公司的高效液相色譜(HPLC)進行檢測[20].檢測條件：C18色譜柱，色譜柱：250 mm×4.0 mm不銹鋼柱， 流動相V(乙腈)∶V(水)=60∶40，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為294 nm，進樣量10 μL.根據魚藤酮標樣的吸收峰面積和樣品魚藤酮吸收峰面積，參照黃繼光等方法[11]，計算三葉魚藤中魚藤酮的含量.

圖1 魚藤酮標樣和三葉魚藤的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectrum of rotenone standard sample and Derris trifoliate

1.4 響應面試驗設計

采用雙因素，五水平的中心旋轉復合設計方法[21].選取因素分別為乙醇濃度和提取時間，根據單因素試驗確定雙因素的水平，軸距為±1.414.利用Design-Expert 8.0.6軟件，經多元線性回歸分析建立經驗二階多項式模型.

1.5 數據分析

響應曲面數據由Design-Expert 8.0.6軟件分析，所有統計分析采用SAS 9.0軟件進行統計分析，進行ANOVA方差分析(p< 0.05).

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

分別選擇乙醇濃度(時間固定為4 d)與提取時間(乙醇濃度固定為80%)優化三葉魚藤中魚藤酮的提取結果如圖2所示.

A) 乙醇濃度; B)提取時間A) Ethanol concentration (Time=4 d); B) Extraction time (Ethanol concentration=80%)圖2 單因素優化魚藤酮含量 Fig.2 Optimization of rotenone content by single factor

2.1.1 乙醇濃度的影響 固定提取時間為4 d，當乙醇濃度增加，三葉魚藤中魚藤酮的含量快速增加，隨后緩慢降低，結果如圖2A所示.當乙醇濃度為80%時，魚藤酮的含量達到最高，為1.93%；原因是：當乙醇濃度增加時，魚藤酮的溶解性增加；當溶解達到飽和后，乙醇濃度的增加，雜質被進一步提取，從而導致魚藤酮含量降低.綜合考慮，70%、80%和90%三個濃度被挑選出進行響應面試驗設計.

2.1.2 提取時間的影響 固定乙醇濃度為80%，隨著提取時間的延長，魚藤酮含量不斷增加；當提取時間為4 d時，魚藤酮含量達到最大值，1.97%；隨后含量下降.由于時間延長，三葉魚藤中的其他成分也被提取，導致魚藤酮總含量下降.綜合考慮，3 d、4 d和5 d三個時間被挑選出進行響應面試驗設計.

2.2 模型的建立

根據上述試驗篩選的結果，選擇乙醇濃度為70%、80%、90%，提取時間為3 d、4 d、5 d；每個因素軸距為±1.414，模型設計見表1.由表1可知，當乙醇濃度為80%，提取時間為4 d時(編號1)，魚藤酮的含量最高，為2.01%.

表1 雙因素的中心復合旋轉設計及考察指標值

續表1

注：X1=乙醇濃度(Ethanol concentration)/%;X2=提取時間(Extraction Time)/d.

通過Design-Expert 8.0.6軟件計算，方差分析結果見表2.由表2可知，模型的p值< 0.0001，表明該二次模型極顯著.同時，乙醇濃度、提取時間兩個因素及其組合的p值都小于0.05，表明因素自身及因素之間達到顯著水平.失擬項值為0.210 7(>0.05)，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，多項式方差具有較好的回歸關系.

表2 二次模型響應面的方差分析結果

注：X1=乙醇濃度(Ethanol concentration)/%;X2=提取時間(Extraction Time)/d.

對上述試驗結果進行回歸分析，得到魚藤酮的二階多項式模型，結果見表3.由表3可知，模型方程相關系數顯著，而失擬項概率不顯著(>0.05)，表明擬合形成的經驗二階多項式模型可用于響應面分析.

表3 魚藤酮含量的二階多項式模型

注：X1=乙醇濃度(Ethanol concentration)/%;X2=提取時間(Extraction Time)/d.

2.3 響應面分析

根據表3擬合的二階多項式模型，利用響應面構建的軟件分析，模擬出乙醇濃度、提取時間與魚藤酮含量的響應曲面如圖3所示.由圖3可知，隨乙醇濃度、提取時間的增加，魚藤酮含量先增加，達到頂點后緩慢降低.形成的三維圖形有明顯的弧面，表明乙醇濃度和提取時間對魚藤酮含量有顯著影響.響應面底面的等高線反映了各因素之間的相關性.由圖3可知，曲面的等高線在底面形成明顯的橢圓形圓心，表明兩個因素之間有很好的相關性.

2.4 最優條件的驗證

根據中心旋轉復合設計方法優化出最佳提取條件見表4.當乙醇濃度為84%，提取時間為4.1 d時，魚藤酮的預測最佳值為2.02%；為此，在此條件下，進行試驗提取魚藤酮，通過色譜分析，得到魚藤酮的含量為1.97%.與試驗值相比較，相對誤差為2.48%(小于5%)，由此表明得到的二階多項式模型可行.

圖3 魚藤酮含量的響應曲面.Fig.3 Response surface of rotenone content

考察指標evaluation indices乙醇濃度EtOH/%提取時間Time/d預測值Predicted value/%試驗值Experimental value/%相對誤差Relative error/%魚藤酮含量/%844.12.021.972.48

3 結論與討論

提取后的溶液進行減壓濃縮，為了避免高溫造成物質變化，本實驗減壓濃縮的溫度控制在45 ℃以下，真空度為0.1個大氣壓.得到的浸膏為墨綠色，顏色較深，會干擾液相色譜檢測的準確性.為此，本實驗采用前處理方法，統一使用活性炭脫色處理，然后進行檢測.乙腈為溶劑測試魚藤酮標樣時，扣除了乙腈溶劑峰.乙醇濃度大小對三葉魚藤中活性物質的提取有較大關系，濃度過大，三葉魚藤中雜質將進一步被提取出來，濃度過小，魚藤酮提取不充分，因此，根據優化以及HPLC檢測，確定其提取最佳濃度.提取時間對魚藤酮含量也有類似結果，時間過長，各種物質被提取出來，魚藤酮含量降低；提取時間較短，魚藤酮提取不充分等.

由此，根據二階多項式模型，得出最佳乙醇濃度為84%，提取時間為4.1 d.在此條件下驗證值為1.97%，如若提取時間延長，將有更多的雜質進入，導致魚藤酮含量下降，進一步純化魚藤酮難度加大；如若提取時間較短，將浪費三葉魚藤材料.因此該結果為實驗室優化提取三葉魚藤中的活性成分提供了較好的理論依據.