cry1A基因通用檢測方法的建立

董美， 胡曉穎， 孟麗霞， 宛煜嵩， 劉衛曉， 金蕪軍， 李亮

(中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081)

隨著轉基因植物不斷地商業化種植與加工，加強轉基因植物的安全監管也顯得日益突出[1-3]。針對轉基因植物建立特異、靈敏的檢測方法是轉基因植物安全監管的重要技術支撐。目前，國內的轉基因植物檢測標準方法以定性PCR為主，僅農業農村部就發布了170余項轉基因檢測國家標準，包括篩選檢測、基因特異性檢測、構建特異性檢測和轉化體特異性檢測[4]。其中，轉化體特異性檢測具有高度的特異性[5-7]，而基因特異性檢測可以檢測出所轉該外源基因的產品，不受整合位點和插入時載體片段缺失等因素的干擾，應用尤其廣泛。

Bt基因來源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt)，因其表達產物Bt毒蛋白具有抗蟲效果好、安全、高效等優點使得其成為國內外應用最廣泛的抗蟲外源基因[8-10]，包括cry1A、cry2Ab、cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab等。其中使用頻次最高、應用最為廣泛的抗蟲基因是cry1A基因，包括cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、cry1Ab/Ac等[11-12]。因此，以cry1A基因作為靶標的通用檢測方法在轉基因植物安全監管中具有極高的應用性。國內外已建立了幾種針對cry1A基因的檢測方法[13-14]，但是，由于不同轉基因植物轉化體中的cry1A類基因在核苷酸序列上有很大的變異性，已有方法僅適用于極少數轉化體，適用范圍窄，亟需建立新的方法。因此，本文以含有cry1A基因的不同作物及其主要的商業化轉化體進行測試，建立cry1A基因特異、靈敏的定性PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 植物樣品與試劑

標準物質購自歐洲標準局(IRMM)，轉基因及非轉基因循環驗證樣品由農業農村部科技發展中心提供，其余部分樣品為實驗室保存樣品，以上樣品均為植物粉末。

植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)購自天根生化科技(北京)生物技術有限公司；GoTaq?Green Master Mix(M7123)購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取和純化 利用植物基因組DNA提取試劑盒對植物粉末樣品提取DNA，按照試劑盒說明書操作，提取的DNA溶液稀釋至25 ng·μL-1備用。

1.2.2引物設計和優化 通過查詢網絡數據庫、國內外專利、科技文獻等方式，對含有cry1A基因的轉基因作物進行序列分析，確定了含有cry1A基因的16種轉基因作物材料(表1)。根據資料上提供的序列，設計引物并擴增測序驗證，再次明確不同轉化體中cry1A基因的序列。利用DNAMAN軟件對測序獲得的序列進行比對分析，利用Primer premier 5.0 軟件進行引物設計。采用簡并引物策略并結合實驗驗證，篩選cry1A基因定性PCR檢測引物。

1.2.3PCR擴增體系和條件優化 根據篩選出的最佳引物組合，調整優化PCR擴增體系中引物的終濃度，設置0.1、0.2、0.4、0.8 μmol·L-1共4個濃度梯度，并以58、60、62、64、66、68 ℃為退火溫度進行PCR擴增。PCR反應體系：GoTaq?Green Master Mix緩沖液12.5 μL，10 μmol·L-1上、下游引物根據上述引物終濃度確定，25 ng·μL-1DNA模板2 μL，用去離子水補至25 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度梯度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35次循環；72 ℃延伸7 min。

1.2.4特異性驗證 根據優化好的PCR擴增體系和反應程序，選取特異性實驗驗證樣品33種對方法進行特異性測試(含有cry1A基因樣品16種，不含cry1A基因及其他樣品17種)。

特異性驗證樣品包括以下類型：(1)含cry1A基因的材料(表1)；(2)不含cry1A基因的材料(部分含其他抗蟲基因)：MON863(cry3Bb1)、MON88017(cry3Bb1)、MIR604(cry3A)、TC1507(cry1F)、MIR162(vip3Aa20)、59122(cry34Ab1、cry35Ab1)、4114(cry1F、cry34Ab1、cry35Ab1)、MON87460、NK603、GA21、3272、T25；(3)非轉基因混合材料：非轉基因油菜、水稻、大豆、玉米、棉花5種混合樣品，每種作物各選取5個非轉基因材料等量混合制成1個樣品。

1.2.5方法檢出限測試 對含有cry1A基因的3種材料(Bt11、MON810、Bt176)，使用購買的歐盟標準物質，對不同質量分數的樣品進行測試，確定方法檢出限。歐盟標準物質每種材料包含以下濃度：轉基因玉米Bt11(質量分數分別為4.89%、1.96%、0.98%、0.49%、0.098%、<0.012%)；轉基因玉米MON810(質量分數分別為9.9%、1.98%、0.49%、<0.09%)；轉基因玉米Bt176(質量分數分別為5.0%、2.0%、1.0%、0.5%、0.1%、<0.014%)。對可檢出最低質量分數的測試樣品，提取60份基因組DNA進行檢出限測試。若60份測試樣品中不少于59份測試結果為陽性，則將該樣品的質量分數確定為方法的相對檢出限。

1.2.6實驗室間循環驗證 選擇7家第三方檢測機構對該方法進行特異性檢測、檢出限測試和重演性分析。參加循環驗證的7家單位分別是農業農村部轉基因環境安全及植物抗性監督檢驗測試中心(北京)、農業農村部谷物及制品質量監督檢驗測試中心(哈爾濱)、農業農村部轉基因植物環境安全監督檢驗測試中心(長春)、農業農村部農產品及轉基因產品質量安全監督檢驗測試中心(杭州)、農業農村部農產品及轉基因產品質量安全監督檢驗測試中心(天津)、農業農村部轉基因生物生態環境安全監督檢驗測試中心(天津)、農業農村部轉基因植物及植物用微生物環境安全監督檢驗測試中心(廣州)。

2 結果與分析

2.1 序列比對及引物設計

利用DNAMAN軟件對測序獲得的序列進行比對分析，結果顯示，這些基因盡管屬于同一類群，但核苷酸序列存在較大差異，保守部分區域較少。利用Primer premier 5.0 軟件先后設計了26對簡并引物進行測試。根據序列比對分析的結果，選擇cry1A基因序列差別較大的3個品系轉基因玉米Bt11、轉基因玉米Bt176、轉基因玉米MON810進行簡并引物的篩選。

由于使用的是簡并引物，不同的測試對象擴增效果存在明顯差異(未列出)。引物對0516-F2(cry1A-F): 5′-C ART T C A A C G A C A T G A A C A G C GC-3′、0516-R4(cry1A-R)：5′-G C T C C A G G C CVG T G T T G T A C CA-3′，擴增片段253 bp，對測試對象的擴增條帶清晰、特異性高，擴增效率一致，確定此引物對為研究對象，進行各類參數測試。

2.2 PCR擴增體系和條件優化

通過引物濃度和退火溫度的正交測試(圖1)，確定引物終濃度0.4 μmol·L-1，退火溫度64 ℃，此條件下PCR擴增效率高、非特異性好、引物二聚體少。

2.3 特異性分析

特異性驗證結果(圖2)顯示，僅從含有cry1A基因的材料中獲得預期擴增產物，而從其他樣品中未獲得預期擴增產物，表明方法特異性符合要求。此外，上述不含cry1A基因的材料中包含了部分Bt基因的其他類別，實驗時均未獲得擴增，表明方法對cry1A基因特異性良好，可以用于cry1A基因的特異性檢測。

A、B、C、D分別表示引物終濃度的4個梯度：0.1、0.2、0.4、0.8 μmol·L- 1；1 & 2、5 & 6、9 & 10、13 & 14、17 & 18、21 & 22分別表示陰性玉米的6個退火溫度梯度：58、60、62、64、66、68 ℃；3 & 4、7 & 8、11 & 12、15 & 16、19 & 20、23 & 24分別表示MON810的6個退火溫度梯度：58、60、62、64、66、68 ℃；M為100 bp DNA Ladder。A, B, C, D show reactions in which the primer concentration are 0.1, 0.2,0.4, 0.8 μmol·L- 1, respectively; lanes 1 & 2, 5 & 6, 9 & 10, 13 & 14, 17 & 18, 21 & 22 show reactions in which the annealing temperature of negative maize are 58, 60, 62, 64, 66, 68 ℃, respectively; lanes 3 & 4, 7 & 8, 11 & 12, 15 & 16, 19 & 20, 23 & 24 show reactions in which the annealing temperature of MON810 maize are 58, 60, 62, 64, 66, 68 ℃, respectively; lane M is 100 bp DNA Ladder.圖1 PCR反應體系和反應程序優化結果Fig.1 Optimization of the primer concentration and the annealing temperature

A：含cry1A基因材料測試結果；M為100 bp DNA Ladder，1～18分別為Bt11、MON89034、Bt176、DAS-81419-2、C0030.3.5、SK12-5、Bt506、MON88017、MON810、MON531、MON15985、T304-40、Kefeng 6、KMD、TT51-1、Kefeng 8、陰性玉米、空白對照。B：不含cry1A基因材料測試結果；M為100 bp DNA Ladder，1～15分別為空白對照、陰性玉米、陽性對照(MON810)、MON863、MON88017、MIR604、TC1507、MIR162、59122、4114、MON87460、NK603、GA21、3272、T25。C：不含cry1A基因混合材料測試結果；1～8分別為油菜混合樣、水稻混合樣、大豆混合樣、玉米混合樣品、棉花混合樣品、陽性對照(MON810)、陰性玉米、空白對照。A: Result of materials containing cry1A gene; M is 100 bp DNA Ladder; lanes 1～18 are Bt11, MON89034, Bt176, DAS-81419-2, C0030.3.5, SK12-5, Bt506, MON88017, MON810, MON531, MON15985, T304-40, Kefeng 6, KMD, TT51-1, Kefeng 8, negative maize, NTC (no-template control). B: Test result of materials excluding cry1A gene; M is 100 bp DNA Ladder, lane 1～15 are NTC (no-template control), negative maize, positive control(MON810), MON863, MON88017, MIR604, TC1507, MIR162, 59122, 4114, MON87460, NK603, GA21, 3272, T25. C: Test result of mixed materials excluding cry1A gene; lane 1～8 are the mixed samples of canola, rice, soybean, maize, cotton, positive control(MON810), negative maize, NTC (no-template control).圖2 引物特異性驗證Fig.2 Specificity of the primer pair

2.4 方法檢出限分析

歐盟標準物質Bt11(0.098%)、MON810(<0.09%)Bt176(0.1%)均能穩定檢出，對可檢出的最低質量分數的測試樣品，60次重復實驗均有擴增條帶，確定方法的檢出限為0.1%(部分結果見圖3)。

A：不同Bt176樣品用量結果；1～6分別為5%、2%、1%、0.5%、0.1% 和<0.014% Bt176樣品； 7為空白對照。B：0.1% Bt176樣品60次重復實驗部分結果；1～12為 0.1% Bt176, 13為陽性對照(1.0% Bt176)，14為陰性玉米；15為空白對照。A: Result of different content of Bt176 samples; 1～6 are 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, <0.014% Bt176 samples, respectively; 7, NTC (no-template control);B： Partial result of 60 replicate with a Bt176 mass fraction of 0.1%; 1～12 are 0.1% Bt176 samples; 13 is positive control (1.0% Bt176); 14 is negative maize, lane 15 is NTC (no-template control).圖3 轉基因玉米Bt176對方法檢出限測試Fig.3 Results of LOD using genetically modified maize Bt176

2.5 實驗室間重復性分析

實驗室間循環驗證測試樣品由農業部科技發展中心委托農業部轉基因植物環境安全監督檢驗測試中心(長春)制備，包括特異性樣品、靈敏度樣品及非轉基因混合樣品。特異性樣品為上述1%的16種材料；靈敏度樣品為0.1% MON810玉米，0.1% MON87701大豆，0.1% TT51-1水稻，0.1% MON531棉花；非轉基因混合樣品包括非轉基因玉米混合樣、非轉基因大豆混合樣、非轉基因苜?；旌蠘?、非轉基因油菜混合樣。以上樣品涵蓋了常見的作物類型。

7家單位的復核驗證結果顯示，僅從含有cry1A基因轉化體的樣品中擴增獲得預期DNA片段，而在其他樣品中未獲得預期片段。驗證結果表明，經過國內同行實驗室的循環驗證，本研究建立的cry1A基因通用PCR檢測方法具有高度的特異性，檢出限為0.1%。

7家驗證單位的多次重復試驗均獲得一致性結果，表明本標準方法具有很好的再現性，符合科學性、先進性和可操作性的原則，能夠滿足轉基因植物及其制品中cry1A基因成分的定性PCR檢測的需要。

3 討論

在轉基因植物檢測過程中，PCR技術因其特異性強、靈敏度高、重現性好，應用最為廣泛。目前，轉基因植物檢測首先要進行基因特異性篩查[4, 15-16]，而cry1A基因作為主要的篩查元件在轉基因玉米、水稻、大豆、棉花的檢測中被廣泛使用[8, 11, 17]。由于cry1A基因在使用時，研發者通常進行一些改造，以提高抗蟲效果。建立轉基因植物中cry1A基因通用檢測方法，最主要的問題是篩選通用性強、特異性好、靈敏度優的引物。國家質檢總局于2012年發布實施的行業標準《轉基因成分檢測 玉米檢測方法》(SN/T 1196—2012)[18]中包含了一種可檢測轉基因玉米中cry1Ab基因的定性PCR方法，但該方法僅適用于Bt176等個別轉cry1A類轉基因玉米轉化體；農業農村部也發布了關于cry1A類的檢測標準，包括《抗蟲轉Bt基因水稻定性PCR方法》(農業部953號公告-6-2007)和《抗蟲轉Bt基因棉花定性PCR方法》(農業部1 485號公告-11-2010)，其中Bt基因的檢測方法與SN/T 1196—2012相同，在轉基因成分的篩查中適用性較差[19-20]。

本研究過程中，通過不同植物中cry1A基因序列的比對，在保守區域設計引物，引物個別堿基采用簡并堿基的方式，以提高檢測方法的通用性[11]。通過篩選得到最佳引物組合，再進行穩健性測試，包括引物濃度和退火溫度的優化，目的是在一定的實驗誤差范圍內(例如加樣誤差、PCR儀的溫度波動)均能獲得預期的擴增。隨后，采用優化的最佳實驗條件，選取不同作物，不同轉化體進行方法特異性測試。本方法開發的過程中發現，大豆DAS-81419-2和玉米bt506在引物結合處堿基錯配位點較多，檢出限附近的測試結果稍差，但仍能滿足監管與檢測要求。該檢測方法只能從含有cry1A基因的材料中檢測到目的片段，而在其他相似的材料中無法檢測到，并且也不會被這些相似物干擾，證明了該檢測方法具有100%的選擇性。檢出限是判斷轉基因生物檢測方法適用性的另一個重要技術指標，反映了因特定分析物含量變化引起的檢測結果變化。檢出限一般定義為在不低于95%的檢出情況下的轉基因含量，嚴格的測試實驗是在60個平行中至少檢出59次陽性，并將這個最低含量定為方法檢出限[21]。實驗采用了3種cry1A基因差異明顯的轉基因有證標準物質進行實驗，檢出限均可達到0.1%，符合定性PCR檢測的要求。

實驗室間循環驗證是邀請7家國內具有資質的實驗室進行檢測特異性和靈敏度的循環驗證，目的是驗證該方法的重復性和再現性[22]。向參與本項工作的其他實驗室以盲樣的形式分發均勻、穩定、已知準確濃度的樣品，各實驗室用統一規定的方法對盲樣進行測試[23-26]。循環驗證結果表明，本研究建立的cry1A基因檢測方法特異性強、靈敏度高、重復性好。綜合以上實驗結果，該方法可以作為cry1A基因檢測的通用檢測方法，為轉基因監管提供服務。