免疫親和凈化-光化學衍生液相色譜檢測不同樣品中的黃曲霉毒素

華麗霞, 曾華蘭, 蔣秋平, 何煉, 葉鵬盛, 張小軍, 韋樹谷,張小紅, 張敏, 王明娟, 何曉敏, 陳超

(四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所, 成都 610300)

黃曲霉毒素(aflatoxin, AFT)是一類主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusspeare)產生的次生代謝產物，具有高毒性及致癌性，1993年被世界衛生組織癌癥研究機構劃定為I類致癌物[1-2]。常見的黃曲霉毒素有AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2，其中AFTB1的毒性最強[3]。黃曲霉毒素容易對堅果類、麥類、飼料等農產品造成污染[4-5]，嚴重影響著食品安全。Li等[6]對我國花生油和芝麻油黃曲霉毒素污染情況進行了抽樣調查，結果發現，50份花生油樣品中，有41份AFTB1含量高達68.51 ug·kg-1；而100份芝麻油樣品中，37份AFTB1檢測值達20.45 ug·kg-1。黃曲霉菌在我國是一種常見的腐生真菌，既是重要的植物病原真菌，又能條件性地感染動物器官[7]，主要產生AFTB1和AFTB2兩種毒素；而寄生曲霉在我國較為罕見，其大多數菌株都能產生黃曲霉毒素，且還可產生G族毒素[8]。目前，越來越多的研究人員對黃曲霉菌株的分布、產毒力及產毒條件進行了系統研究，有助于分析預防和減少黃曲霉毒素污染的關鍵控制點，建立相關預防措施[9-10]。

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測是一種常用的黃曲霉毒素檢測技術，能同時對樣品中的黃曲霉毒素種類進行定性、定量分析，具有快速、高效、靈敏、定量準確等優點，在黃曲霉毒素檢測方面發揮著重要的作用，已經成為檢測黃曲霉毒素的主要方法[11-13]。由于AFTB1及AFTG1熒光強度較弱，需進行柱前或柱后衍生來增強熒光強度。柱后光化學衍生是近期發展起來的一項技術，該方法儀器安裝、使用簡單，對提取凈化液無需進行額外的化學處理即可上機檢測，分析快速簡捷，在實際生產中得到越來越廣泛的應用[14-17]。為了提高檢測靈敏度，減少雜質干擾，通常需要對黃曲霉毒素提取液進行凈化。免疫親和柱(immunoaffinity chromatography，IAC)是專用于黃曲霉毒素凈化分離的固相萃取主要方法之一，使用抗體-抗原的特異性吸附原理，能選擇性吸附黃曲霉毒素，具有準確性高、靈敏度好等優點[18]。

本研究利用免疫親和凈化結合光化學柱后衍生液相色譜方法，對油脂類、堅果類及菌株培養物3種類型物質中的黃曲霉毒素進行檢測，探索該方法在不同物質，特別是菌株培養物中黃曲霉毒素檢測的適用性，以期為深入了解黃曲霉菌株的產毒情況及毒素積累規律提供重要的檢測技術，為農產品安全監控提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，配熒光檢測器G1321A；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；PriboFast?KRC光化學衍生反應裝置(Pribolab)；黃曲霉毒素總量免疫親和柱(PriboFast?IAC-011-3)。

色譜純甲醇、乙腈(美國Fisher)；黃曲霉毒素總量標準品[Pribolab, AFTB1(1.00±0.05) ug·mL-1、AFTB2(0.29±0.04) μg·mL-1、AFTG1(1.00±0.03) ug·mL-1、AFTG2(0.29±0.01) μg·mL-1]；待測樣品：花生油3份、花生仁5份，黃曲霉菌株5個。

1.2 方法適用性分析

1.2.1標準曲線的繪制 將黃曲霉毒素總量標準品稀釋成7個不同濃度的標準系列工作液，用于標準曲線的制作，其中AFTB1和AFTG1系列標準工作液濃度分別為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng·mL-1；AFTB2和AFTG2系列標準工作液濃度分別為0.03 、0.15、0.6、1.5、3.0、6.0、12.0 ng·mL-1。對系列標準工作液進行液相色譜檢測，記錄峰面積。

1.2.2精確性、重復性及穩定性分析 將黃曲霉毒素總量標準品稀釋100倍，分別在不進行光化學衍生與經過光化學衍生反應裝置2種條件下進行色譜分析，分析光化學衍生裝置對黃曲霉毒素衍生的適用性。

對同一個稀釋樣品進行6次進樣檢測，記錄峰面積并計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，分析檢測方法的精確性及穩定性；同時，間隔30 min、2 h、24 h、52 h記錄峰面積并計算RSD，分析檢測方法的穩定性。

1.3 樣品提取

1.3.1油脂類樣品 稱取3份花生油樣品(編號分別為Y1～Y3)各5 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(體積比80∶20)，置于搖床中振蕩20 min，隨后在6 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到上清液。

1.3.2花生仁樣品 將待測的5份花生仁樣品(編號分別為K1～K5)用粉碎機進行粉碎，并用勻漿機混勻。隨后稱取5份花生仁粉碎樣品各5 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(體積比80：20)，置于搖床中振蕩20 min，隨后在6 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到上清液。

1.3.3真菌培養物 在PDA平板培養基上接種5個黃曲霉菌株(編號分別為H1～H5)，28 ℃黑暗培養15 d。將長滿皿的菌株連同培養基進行勻漿處理，取5 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(體積比80∶20)，置于搖床中振蕩20 min，隨后在6 000 r·min-1的條件下離心10 min，得到上清液。

1.4 樣品凈化

取4 mL上清液于黃曲霉毒素免疫親和柱中，按照說明書收集黃曲霉毒素，最后用2 mL甲醇溶液將吸附在免疫親和柱中的黃曲霉毒素進行洗脫，用0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶中待用。

1.5 色譜條件

以水為流動相A，甲醇-乙腈(50:50)為流動相C，按照70%水-30%甲醇-乙腈(50:50)進行等度洗脫。流速為1 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量50 μL，檢測波長：激發波長360 nm，發射波長440 nm。

1.6 數據處理

采用Agilent Technologies ChemStation (Rev. B. 03.02) 軟件對檢測結果進行數據處理；用Excel計算峰面積平均值及相對標準偏差(RSD)，根據標準溶液濃度及峰面積繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 光化學衍生對黃曲霉毒素的衍生效果

圖1顯示,在不使用光化學衍生裝置進行衍生的情況下，AFTB2與AFTG2可以被檢測到峰，而AFTB1、AFTG1幾乎檢測不到峰；經過光化學衍生反應裝置后，提高了AFTB1、AFTG1的檢測靈敏度，檢測峰面積大大提高，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1的保留時間分別是11.8、15.4、17.1、22.7 min。

圖1 光化學衍生對黃曲霉毒素的衍生效果Fig.1 Derivative effect of photochemical dervatization on AFT

2.2 光化學衍生的精確性、重復性與穩定性評價

光化學衍生的精確性、重復性分析結果見表1。對同一標準品進行連續重復進樣，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1峰面積RSD均低于2%，表明光化學衍生對黃曲霉毒素檢測具有良好的精確性。對6次重復稀釋樣品進行檢測，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1峰面積RSD均低于3%，表明光化學衍生對黃曲霉毒素檢測具有良好的重復性。對同一個稀釋標準品進行不同時間段的檢測，結果顯示，AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB1峰面積RSD均低于2%，表明光化學衍生檢測黃曲霉毒素的方法在52 h內具有穩定性。

2.3 標準曲線線性范圍的確定

配置黃曲霉毒素AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2標準工作液并進行檢測，以濃度(ng·mL-1)為橫坐標(x)，所對應的峰面積為縱坐標(y)，做回歸曲線。結果表明，AFTB1、AFTG1在0.1～40.0 ng·mL-1的范圍內有良好的線性關系，AFTB2、AFTG2在0.03 ～12.0 ng·mL-1的范圍內有良好的線性關系，R2值均達到0.999(圖2)。

2.4 不同類型樣品中黃曲霉毒素的檢測結果

由樣品檢測峰形圖(圖3)可以看出，黃曲霉毒素總量免疫親和柱(PriboFast?IAC-011-3)對不同類型樣品的黃曲霉毒素提取液都具有顯著的純化效果，且不存在明顯的干擾峰。對花生油、花生仁、黃曲霉培養物等13份樣品進行檢測，結果如表2所示。3份花生油樣品中，有1份檢測出含AFTB1與AFTB2；5份花生仁樣品中，1份檢測出含AFTB1與AFTB2；而在5份的黃曲霉培養物中，有3份檢測到AFTB1，這3個菌株可鑒定為產毒菌株，其余2個菌株可能為不產毒菌株。

表1 精確性、重復性及穩定性分析結果Table 1 Accuracy, repeatability and stability analysis results

圖2 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2線性范圍Fig.2 Linear ranges of AFTB1, AFTB2, AFTG1, AFTG2

圖3 不同類型樣品的光化學衍生液相色譜圖Fig.3 Photochemical derivatization-HLPC chromatograms of different types of samples

表2 樣品中黃曲霉毒素含量Table 2 AFT content in different kinds of samples(ug·kg-1)

3 討論

黃曲霉毒素是一類對人類健康危害較大的真菌毒素，黃曲霉毒素污染問題長期受到社會關注[19-20]。因此，對黃曲霉毒素的檢測與防控是保障食品安全、維護人類健康的重要環節。由于黃曲霉侵染可發生在生產、加工、倉儲及運輸等任何一個環節，通過有效的檢測技術對黃曲霉菌株進行產毒及毒素積累情況的分析，有利于從源頭上尋找到預防黃曲霉毒素污染的關鍵控制點，制定出有效的預防措施。

本研究探討了黃曲霉毒素免疫親和柱結合光化學柱后衍生液相色譜的方法對油脂類、堅果類及黃曲霉菌株培養物等不同樣品黃曲霉毒素檢測的可行性。結果表明，該方法方便快捷，能將AFTG2、AFTG1、AFTB2、AFTB14種毒素的峰明顯區分開，且沒有干擾峰，實現對黃曲霉毒素的定性定量分析，不僅可用于食品和農產品的檢測，還可以用于對黃曲霉菌株產毒情況的分析鑒定，從源頭上探索黃曲霉毒素的積累規律，為進一步制定相應的黃曲霉毒素污染防控措施提供重要的參考信息。

雖然黃曲霉是農產品和食品中最常見的真菌，然而并非所有的黃曲霉菌株都能產生黃曲霉毒素。據報道，自然界中大約10%的菌株能產生毒素[21]。本研究對3份花生油、5份花生仁、5份黃曲霉菌株培養物進行了黃曲霉毒素檢測，結果發現，供試樣品中花生油及花生仁樣品各有1份被黃曲霉毒素污染，毒素類型為AFTB1和AFTB2，且AFTB1含量高于AFTB2含量，檢測結果與前人研究結果相吻合[8]；而5份黃曲霉菌株培養物有3份只檢測到AFTB1，這可能跟采樣地點有關，因為這5份菌株都采集自成都平原地區的花生種植區(青白江、新都、簡陽)。在后續工作中，需要擴大菌株樣本的采集范圍，對不同地理環境下的黃曲霉菌株產毒情況及產毒類型進行深入研究，為農產品產地安全風險評估提供參考信息。由于在菌株培養時，并沒有嚴格地進行定量培養，因此無法嚴格比較得出這3株產毒菌株的產毒能力。在后續的工作中，應深入對產毒菌株的產毒強弱及毒素積累情況進行定量比較分析，為探索黃曲霉菌株產毒機制提供參考信息。