鹽脅迫對蒙桑種子萌發及幼苗生長的影響

閆晶秋子, 李鋼鐵*, 王月林, 麻云霞, 楊穎

(1.內蒙古農業大學沙漠治理學院, 呼和浩特 010018; 2.內蒙古自治區草原工作站, 呼和浩特 010017)

土壤鹽漬化是因人類活動或自然引起的一種重要環境問題，全世界約有3.8億hm2的土壤受到鹽漬化的威脅，占可耕地面積的10%[1]。在我國，鹽漬土總面積約為3 300萬hm2[2]，其中鹽荒地2 600萬hm2，次生鹽漬化土壤700萬hm2，約占可耕地面積的25%[3-4]。不斷加劇的土壤鹽漬化問題，嚴重威脅著農區農業生產力，制約農林業生產發展和生態環境的改善。因此，確定水土保持樹種耐鹽范圍，種植耐鹽抗鹽植物是改善土壤鹽漬化，提高農林業生產能力的主要有效措施。

蒙桑(MorusmongolicaSchneid.)廣泛分布于我國華北、東北、西北等地區，其生長迅速，植株高大，枝繁葉茂，適應性強，是防風固沙的優良樹種[5]。此外，蒙桑材質堅硬，供制器具，樹皮用于纖維造紙及人造棉原料，根皮、果實可入蒙藥，莖、葉可制成動物飼料[6]。目前，蒙桑逐漸成為我國北方改造土壤鹽漬化的主要樹種之一，但關于蒙桑抗逆性方面的研究卻少有報道，特別是蒙?？果}性方面的研究尚未見報道。

種子萌發到成長為幼苗是植物生命期中極為脆弱且關鍵的時期，是植株建成、成林質量、保持自身繁衍的主要環節[7]。而種子能夠在鹽脅迫條件下吸脹萌發是植株適宜在鹽堿地種植的基本條件，所以，種子萌發時期是對植物進行耐鹽性評價的重要時期。故本試驗采用中性鹽NaCl進行脅迫處理，研究不同鹽濃度脅迫對蒙桑種子萌發特性及幼苗生理指標的影響，探索鹽脅迫條件下蒙桑種子萌發及幼苗生長與土壤中鹽分的關系，為培育和保護抗鹽植物資源提供背景信息，為鹽堿地帶植物種群的重建和植被恢復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蒙桑種子采于內蒙古農業大學校園內(E 111°71′12″，N 40°81′17″)。2018年6月初，采摘成熟落地的桑果，帶回實驗室，將桑果充分揉搓，水選剔除空粒和雜質后，自然風干備用。

1.2 試劑

根據李思遠[8]的調查研究，內蒙古自治區呼和浩特地區的鹽堿土大都為碳酸鹽漬土，pH為9.19～9.76，可溶性鹽總質量分數為0.157 6%～0.349 8%。對該地區碳酸鹽漬土環境進行檢測，得到不同鹽堿摩爾配比為NaCl：MgCl2：CaCl2：Na2SO4：NaHCO3：Na2CO3=19.00∶1.27∶1.00∶10.00∶2.63∶2.37。本試驗為簡化試驗設計，選取碳酸鹽漬土中含量最多的NaCl為處理試劑，購自天津市致遠化學試劑有限公司。

1.3 種子萌發脅迫處理

選取顆粒飽滿、形狀大小均一的成熟蒙桑種子，消毒洗凈后，將50粒種子置于放有2層濾紙，直徑12 cm的培養皿中。取不同濃度的NaCl溶液或蒸餾水10 mL，使濾紙浸透。蓋上培養皿蓋，之后每天定時更換培養皿并補充NaCl溶液及蒸餾水，保證各培養皿鹽濃度不變。試驗共設置6個處理，包括0(蒸餾水對照)、20、30、50、70、100 mmol·L-1NaCl溶液，每個處理重復3次。將培養皿放入GZX-250型光照培養箱(北京凱迪萊特儀器設備有限公司)內，溫度30 ℃，連續光照培養15 d。

1.4 幼苗生長脅迫處理

將蒙桑種子浸泡于28 ℃清水中，進行48 h催芽處理后，播種于以干凈河砂為基質，高15 cm，直徑12 cm的花盆內。1個月后，選取長勢相同幼苗18盆，每盆留30株，隨機分為6組，量取100 mL濃度為0、20、30、50、70、100 mmol·L-1的NaCl溶液進行處理，利用稱重法定時補充花盆損失水分，保證鹽濃度不變。每組重復3次，共18個處理，連續脅迫處理15 d。

1.5 指標測定

1.5.1種子指標測定 種子千粒重：稱取1 000粒種子的重量，重復3次，取平均值。

種子大?。豪煤撩准?，測量100粒種子的長軸和短軸，取平均值。

種子活力：根據國家標準GB2772-81《林木種子檢驗方法》[9]，隨機選取蒙桑種子100粒進行TTC法活力測定，并統計結果。

測定出供試材料千粒重為(9.152 1±0.000 5) g，種子長軸長為(1.202 1±0.001 0) mm，短軸長為(0.551 4±0.001 5) mm，且種子活力在90%以上。

1.5.2生長指標測定 以胚根長度達種子長軸的1/2視為發芽，每天早上8:30觀察，記錄種子萌發數，并測量胚根、胚芽長度。

萌發率(germiantion rate，Gr)=n/N×100%

式中，n為萌發種子數，N為播種種子數[10]。

發芽指數(germination index，Gi)=∑(Gt/Dt)

式中，Gt為第t日的萌發數，Dt為相應的萌發天數。

活力指數(vitality index，Vi)=S×Gi

式中，S為胚根長度加胚軸長(cm)[11]。

生長速率=L/∑[Ni×(Dt-Di+0.5)]

式中，L指每一培養皿全部萌發種子胚根長度的總合；Ni指第i天的萌發種子數；Dt指實驗持續的天數(15 d)，Di指第i天[12]。

根伸長抑制率=(對照胚根長-處理胚根長)/對照胚根長×100%

芽伸長抑制率=(對照胚芽長-處理胚芽長)/對照胚芽長×100%

耐鹽指數=Vi鹽/Vi水×100

式中，Vi鹽為鹽脅迫下的萌發活力指數，Vi水為對照下的萌發活力指數[13]。

相對鹽害率[14]=(對照萌發率-處理萌發率)/對照萌發率×100%

耐鹽臨界值：將NaCl濃度與上述生長指標進行相關分析，如果存在相關性，進行回歸分析，根據回歸方程得到相應生長指標的耐鹽臨界值。耐鹽臨界值的判斷標準[15]為：若所測指標與鹽濃度為正相關關系，則其耐鹽臨界值是對照增加200%時所對應的值，若所測指標與鹽濃度為負相關關系，則其耐鹽臨界值是對照降低50%時所對應的值。

1.5.3生理指標測定 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[16]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定采用NBT還原法[17]，可溶性糖(soluble sugar，SS)含量的測定采用蒽酮比色法[16]，脯氨酸(proline，Pro)含量的測定采用茚三酮顯色法[16]，可溶性蛋白質(soluble protein,SP)含量的測定采用考馬斯亮藍法[16]，膜透性(相對電導率)的測定采用浸泡法[18]，葉綠素(chlorophyll，Chl.)含量測定采用紫外分光光度法[16]。

上述生理指標均使用UV759紫外可見分光光度計(上海奧普勒儀器有限公司)進行測定。

1.6 數據分析

利用Microsoft excel 2010進行數據分析和處理，SPSS 20.0 軟件進行方差分析、回歸分析及顯著性檢驗，相關性分析采用Pearson法，多重比較采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對蒙桑種子萌發的影響

不同NaCl濃度下蒙桑種子萌發結果(圖1)表明，隨NaCl濃度不斷升高，蒙桑種子萌發率、發芽指數、活力指數均出現不同程度下降，且各處理與對照均存在顯著性差異。與對照相比，20、30、50、70、100 mmol·L-1的NaCl處理的萌發率分別下降13.95%、37.21%、41.86%、48.84%、51.05%；發芽指數分別下降21.36%、45.06%、49.02%、55.45%、59.08%；活力指數分別下降59.41%、79.41%、81.76%、95.29%、98.08%；說明鹽溶液抑制蒙桑種子萌發，降低其活力。

注：不同字母表示同一指標不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note：Different letters of the same index indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖1 不同濃度NaCl溶液對蒙桑種子萌發的影響Fig.1 Effects of different concentrations NaCl solution on germination of M. mongolica seeds

種子萌發率體現特定環境下種子的生活力，發芽指數和活力指數則綜合了發芽時間和胚根生長情況兩方面特征，全面反映種子活力及其幼苗生長發育情況。圖1說明，鹽脅迫不僅抑制蒙桑種子吸水萌發，還影響幼苗胚根、胚芽的正常生長，大大降低蒙桑種子發芽指數和活力指數，進一步影響蒙桑種子發育成苗。

2.2 NaCl脅迫對蒙桑種苗生長的影響

2.2.1NaCl脅迫對蒙桑種子胚根、胚芽生長的影響 植物胚根的伸長程度是植物是否可以成苗的關鍵。如表1所示，經過15 d脅迫，胚根長度隨NaCl濃度的升高不斷降低，且除了30 mmol·L-1和50 mmol·L-1脅迫下，其余各組間均存在顯著性差異，胚根長度由對照組的32.53 mm下降到100 mmol·L-1時的1.47 mm，下降95.48%；當NaCl濃度不斷增加時，胚根生長速度逐漸變緩，除20 mmol·L-1脅迫下與對照差異不顯著，其余各組均有顯著性差異，胚根生長速度由對照組的0.65 mm·d-1降至100 mmol·L-1時的0.26 mm·d-1，放緩近60%。根、芽伸長抑制率從側面反映NaCl濃度對種子生長的影響。表1可以看出，根、芽伸長抑制率隨NaCl濃度的升高逐漸增大，當NaCl濃度為100 mmol·L-1時，根、芽伸長抑制率達到最大值，分別為95.48%和69.64%。充分說明，鹽濃度升高抑制胚根、胚芽伸長發育，蒙桑種子抗鹽能力一般。

表1 不同濃度NaCl溶液對蒙桑種子胚根、胚芽的影響Table 1 Effects of different concentrations NaCl solution on radicle and plumule of M. mongolica seeds

將鹽脅迫濃度與各指標之間進行相關性分析，所得結果(表2)可以看出發芽率、活力指數、胚根長度、胚根生長速度與鹽脅迫濃度呈顯著負相關關系，計算得鹽脅迫下發芽率、活力指數、胚根長度、胚根生長速度的耐鹽臨界值分別為2.55、59.71、2.42、0.67 mmol·L-1(表3)。

表2 蒙桑種子、幼苗指標與鹽濃度的相關關系Table 2 Correlation analysis between seed and seedling indexes of M. mongolica and NaCl concentration

表3 蒙桑種子、幼苗指標與鹽濃度的回歸方程Table 3 Regression equation of M. mongolica seed and seedlings indexes and salt concentration

2.2.2NaCl脅迫對蒙桑種子耐鹽指數和相對鹽害率的影響 種子耐鹽指數和相對鹽害率分別表示種子對鹽脅迫的耐受程度和種子遭受鹽脅迫時的損害程度。如表4所示，隨NaCl濃度升高，蒙桑種子耐鹽性大幅降低。當NaCl濃度為20 mmol·L-1時，其耐鹽指數降低至對照的50%；100 mmol·L-1時，耐鹽指數低至1.92，與對照相比，下降98%。當NaCl濃度由20 mmol·L-1增加至100 mmol·L-1時，蒙桑種子均受到顯著傷害。

表4 不同NaCl濃度對蒙桑種子耐鹽指數、相對鹽害率的影響Table 4 Effects of different NaCl concentrations on salt tolerance index and relative salt damage rate of M. mongolica seed.

2.3 NaCl脅迫對蒙桑幼苗生理指標的影響

2.3.1NaCl脅迫對蒙桑幼苗丙二醛及SOD活性的影響 不同處理的蒙桑幼苗丙二醛含量結果(圖2)表明，隨著NaCl濃度的升高，蒙桑幼苗MDA含量呈上升趨勢， 與對照相比，20、30、50、70、100 mmol·L-1NaCl處理的MDA含量分別上升2.09%、9.24%、11.78%、15.73%和16.67%。除20 mmol·L-1NaCl溶液外，其余處理與對照均存在顯著性差異。

隨NaCl濃度升高，蒙桑幼苗SOD活性上升后大幅下降(圖2)。30 mmol·L-1NaCl溶液脅迫下，SOD活性達到最大值，為51.05 U·g-1·min-1，比對照上升1.82%，但沒有顯著性差異；50 mmol·L-1NaCl處理SOD活性即顯著下降，至100 mmol·L-1NaCl處理，SOD活性降為39.66 U·g-1·min-1，比對照下降20.88%。說明，鹽脅迫可誘導蒙桑幼苗葉片過氧化酶活性，鹽溶液達到50 mmol·L-1以上，蒙桑幼苗SOD活性受到顯著抑制，影響蒙桑幼苗的生長發育。

注：不同字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note：Different letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖2 不同濃度NaCl處理對蒙桑幼苗MDA和SOD活性的影響Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on MDA content and SOD activity of M. mongolica seedlings.

2.3.2NaCl脅迫對蒙桑幼苗滲透調節物質的影響 不同處理的蒙桑幼苗滲透調節物質結果(圖3)表明，隨NaCl濃度升高，蒙桑幼苗可溶性糖、可溶性蛋白質、脯氨酸含量均呈上升趨勢。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，SS含量最高，為8.19 mg·g-1，與對照相比，顯著上升53.22%；50 mmol·L-1NaCl溶液脅迫下，SS含量為5.36 mg·g-1，與對照無顯著性差異。20、30、50、70、100 mmol·L-1的NaCl處理的SP含量分別較對照顯著上升5.18%、8.59%、12.14%、15.62%和19.17%，Pro含量分別顯著上升14.22%、36.37%、64.31%、85.66%和92.90%。說明在鹽脅迫環境下，蒙桑幼苗利用滲透調節物質的積累來調節和平衡體內的滲透壓，以緩解鹽脅迫帶來的不利影響。

注：不同字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note：Different letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖3 不同濃度NaCl處理對蒙桑幼苗可溶性糖、可溶性蛋白質和脯氨酸含量的影響Fig.3 Effects of different NaCl concentrations on soluble sugar, soluble protein and proline content of M. mongolica seedlings.

2.3.3NaCl脅迫對蒙桑幼苗膜透性及葉綠素的影響 由圖4可知，隨NaCl濃度升高，蒙桑幼苗相對電導率呈階梯狀上升，Chl.含量呈下降趨勢。20、30、50、70、100 mmol·L-1NaCl處理的相對電導率較對照分別上升7.67%、15.75%、27.38%、47.33%和62.09%，且達到顯著性差異；Chl.含量分別下降9.63%、28.03%、29.06%、37.44%、43.42%。說明在NaCl溶液脅迫下，蒙桑幼苗細胞膜受損，電解質滲透量不斷加大，葉綠素合成受到抑制，幼苗光合能力下降。

注：不同字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note：Different letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖4 不同濃度NaCl處理對蒙桑幼苗相對電導率和葉綠素含量的影響Fig.4 Effects of different NaCl concentrations on relative conductivity and chlorophyll content of M. mongolica seedlings.

3 討論

隨NaCl濃度升高，蒙桑種子的萌發能力和活力均大幅下降，這與前人在梭梭[19]、黃瓜[20]、黑果枸杞[21]、桑[22]種子鹽脅迫中的研究結果一致。本研究認為，通過蒙桑種子的萌發率、發芽指數、活力指數這3個指標可以直接反應出其抗鹽脅迫能力的強弱。結果表明，當NaCl濃度為20 mmol·L-1時，除胚根生長速度這一指標與對照差異不顯著，萌發率、胚根長度、發芽指數、活力指數、耐鹽指數、相對鹽害率、根伸長抑制率、芽伸長抑制率這8項指標，與對照均存在顯著性差異，說明蒙桑種子對NaCl濃度變化非常敏感。耐鹽臨界值的分析說明，蒙桑種子的胚根長度對NaCl濃度變化較為敏感，其次為活力指數和發芽率，胚根生長速度最不敏感，這與劉寶玉等[15]的研究結果一致，但與李志萍等[23]在鹽脅迫對栓皮櫟種子萌發及幼苗生長的影響中所得研究結論不一致，可能是與栓皮櫟種子種皮較厚，鹽溶液滲透需要時間較長有關。本研究結果表明，蒙桑種子最小耐鹽臨界值為0.67 mmol·L-1。祝娟娟等[24]研究測得河南桑和粵桑耐鹽臨界值分別為0.54 mmol·L-1和0.62 mmol·L-1，張國英[25]測得豐馳桑種子耐鹽臨界值為0.59 mmol·L-1，均小于本試驗測得結果。程波等[26]在NaCl濃度為100 mmol·L-1時，測得“冰馳”苜蓿種子耐鹽臨界值為0.78 mmol·L-1，略大于蒙桑種子耐鹽臨界值，說明蒙桑種子抗鹽堿性次于“冰馳”苜蓿種子。綜上所述，蒙桑種子具有較強的抗鹽性，適宜在中度鹽脅迫下環境種植。與同屬的河南桑、粵桑和豐馳桑等相比，均表現出較好的耐受性。

植物在鹽脅迫環境下，膜系統是植物鹽害的主要部位。細胞膜受到損害，將產生大量MDA[27]，細胞液中有機滲透物質流出[28-29]，與此同時，植物體內的保護酶系統被激活，SOD便是其中重要成員之一[30]。本研究結果表明，隨著鹽脅迫程度不斷增加，蒙桑幼苗體內的SOD酶活性呈先升高后降低趨勢，而MDA含量和相對電導率逐漸升高，說明在30 mmol·L-1NaCl溶液脅迫下，蒙桑幼苗的保護酶活增強，提高了幼苗清除自身活性氧的能力，減輕了膜脂過氧化程度。因此，蒙桑幼苗在NaCl濃度為30 mmol·L-1脅迫下，MDA含量升高，但與對照不存在顯著性差異。當NaCl濃度升高為50 mmol·L-1時，超出蒙桑幼苗的抗鹽能力，其體內過多積累的活性氧對保護酶造成損害，使SOD等保護酶活性降低，造成并加劇膜脂過氧化強度和膜系統傷害的程度[31-32]。

滲透調節是植物在逆境脅迫下的一種非常重要的自我生理保護機制。在鹽脅迫環境下，細胞發生滲透，植物體通過提高自身有機滲透調節物質含量，使細胞內滲透勢降低，增強抗鹽能力。其中有機滲透調節物質主要包括可溶性糖、可溶性蛋白質以及脯氨酸?？扇苄蕴菍χ仓瓯３肿陨砘盍熬S持細胞膜穩定具有很大作用[33]；可溶性蛋白質的多少說明植物體的代謝狀況；脯氨酸起到細胞質內滲透調節的作用，幫助植物減緩外界脅迫傷害[34]。大量研究表明，鹽脅迫處理后植物體內有機滲透調節物質含量明顯升高[35-37]。本試驗中，隨NaCl濃度升高，蒙桑幼苗可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量和脯氨酸含量均顯著性升高。由此可知，在鹽脅迫環境下，蒙桑幼苗可通過調節自身的滲透有機質，使體內滲透壓降低，以便適應外界環境。

已有研究表明[38-39]，農桑14號、農桑12號、湖桑32號以及白榆幼苗在NaCl濃度為100 mmol·L-1時，便出現植株萎蔫，葉片尖端甚至整片葉泛黃，部分植株死亡的現象，林興生等[40]試驗表明，當NaCl濃度為100 mmol·L-1時，“稗草”、“萊竹”2種菌草葉片均呈失綠癥狀，死亡率為40%。而本試驗結果說明，蒙桑幼苗在鹽濃度為100 mmol·L-1時，生長發育良好，無死亡植株，且沒有萎蔫泛黃現象，說明蒙桑幼苗具有較強的抗鹽能力。

綜上所述，在鹽脅迫條件下，蒙桑種子的萌發和幼苗的生長均受到抑制。蒙桑種子在NaCl溶液濃度大于0.67 mmol·L-1環境下生長培育，便受到鹽脅迫的損害，但蒙桑種子通過胚芽短小卷粗、胚根縮短增粗抵御鹽脅迫。對于幼苗而言，隨著鹽脅迫程度不斷加深，蒙桑幼苗啟動自身防御機制，通過提高SOD等保護酶活性，降低由MDA含量積累造成的膜脂過氧化程度?？扇苄蕴?、可溶性蛋白質和脯氨酸的積累，可調節細胞滲透勢，降低鹽脅迫對蒙桑幼苗的傷害程度，保護原生質，防止細胞失水，保護生物大分子結構與功能的穩定。相對電導率和葉綠素能直接反映出處理期間鹽脅迫對蒙桑幼苗的傷害程度，研究表明，當細胞膜系統遭到破壞，隨著脅迫時間延長，蒙桑幼苗葉片出現輕微萎蔫的現象。根據李思遠[8]對碳酸鹽漬土含鹽量調查，結合本試驗結果，可以看出，在碳酸鹽漬土地區，通過播種繁殖培育蒙桑較為困難，而蒙桑幼苗具有良好的抗鹽性，可通過移植、無性繁殖等繁育方式對蒙桑幼苗進行培育，形成規模，有利于改良土壤成分。本研究為今后深入研究蒙桑資源耐鹽性評價，篩選和培育耐鹽堿品種以及制定耐鹽堿栽培措施提供參考依據。