鹽脅迫下水稻體內miRNA表達譜分析

張秀妍,徐妙云,鄭紅艷,鄒俊杰,張笑宇,王磊*

(1.內蒙古農業大學園藝與植物保護學院, 呼和浩特 010018;2.中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081)

高鹽脅迫是水稻生產中常見的非生物逆境，嚴重影響了水稻的生長發育和最終產量[1]。目前,提高植物耐鹽性的途徑主要有兩種：一是改良和治理鹽土，其次是深入探究鹽脅迫對植物的傷害機制，挖掘植物應答鹽脅迫的重要基因，通過分子育種手段培育耐鹽品種。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物體內，長度為21～25 nt的單鏈非編碼小RNA分子，參與基因的轉錄后調控，通過與靶mRNA完全匹配或者部分匹配的方式將靶基因降解或抑制靶基因的翻譯[2-6]。大量研究發現，miRNA在植物體內應對非生物脅迫過程中發揮著重要作用，這也是近年來研究的焦點[7-11]。鹽脅迫下，水稻葉片中Os-miR414、Os-miR408和Os-miR164e下調表達[12]，Os-miR29上調表達[13]。這些miRNA通過與靶基因作用對植物的生長發育進行調控，進而應對環境中的鹽脅迫。并且同一種miRNA在不同處理條件下表達趨勢不同。例如，在水稻中，Os-miR393在鹽[14]、干旱[15]、低溫[14]處理后均上調表達，在鋁脅迫中[16]下調表達；Os-miR319a在脫落酸處理后下調表達，在赤霉素處理后上調表達[17]。

通過高通量測序可以在全基因組水平上鑒定生物體內小RNA的表達譜、挖掘新的miRNA分子、預測靶基因、鑒定樣品間的差異表達。在植物遭受非生物逆境脅迫期間，必然會應激表達一些miRNA，這些miRNA的靶基因大多是轉錄因子，往往參與一些重要的信號途徑。但是，在鹽脅迫處理不同時間，植物體內應激所產生miRNA的類型及表達量變化如何尚需研究，因此，本文利用高通量測序及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法，研究水稻幼苗在鹽脅迫處理下不同時間點差異miRNA及其靶基因的表達模式，以期為耐逆miRNA的發現和鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試水稻材料 本研究所用水稻材料為OsPIR1(LOC_4334762)基因沉默材料，背景為日本晴，來源于滾環復制介導發卡RNA法構建的RNAi突變體庫[18]。

1.1.2試劑與試劑盒 EASYspin Plus多糖多酚復雜植物RNA快速提取試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，用于RNA提取；VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina試劑盒購自NEB公司，用于sRNA文庫構建；Mon ScriptTM5×RT Ⅲ All-in-One Mix試劑盒購自莫納公司，用于將RNA反轉錄為cDNA第一鏈；SYBR GreenTMPremixExTaqTM試劑盒購自TaKaRa公司，用于熒光定量檢測基因表達。

1.2 水稻材料的培養與處理

選取當年收獲的飽滿水稻種子置于三角瓶中，于光照培養箱37 ℃培養一周打破休眠后，先用75%乙醇消毒3 min，無菌水洗一遍，然后用2.5%的次氯酸鈉消毒30～60 min，最后用無菌水浸泡1～2 h。將已消毒的水稻種子置于酸性花肥土中用小花盆土培，每盆15株。光照培養箱溫度為28 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，相對濕度為60%～80%，適時補水。待苗長至二葉期時，挑選大小一致的幼苗進行鹽脅迫處理。

鹽處理：選取長勢一致的水稻植株150株，加入終濃度為150 mmol·L-1的鹽水，補水均使用終濃度為150 mmol·L-1的鹽水。在處理0、24、72 h分別對水稻根系、莖干及葉片取樣，樣品共分9組，分別命名為0 h-R(Root)、0 h-S(Stem)、0 h-L(Leaf)、24 h-R、24 h-S、24 h-L、72 h-R、72 h-S、72 h-L。樣品立刻置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 小RNA文庫構建

分別提取9組樣品的總RNA，要求所有樣品濃度 ≥ 100 ng·μL-1，總量 ≥10 μg，RIN ≥6.0，A260/A280>2.1，保證使用合格的樣品進行測序。樣品檢測合格后，以總RNA為起始樣品，分離得到18～30 nt的目的片段，利用T4 RNA連接酶分別在小RNA 3′端和5′端連接上接頭，反轉錄合成cDNA，PCR擴增后構建sRNA文庫。將文庫構建好后，使用Illumia Solexa測序技術進行高通量測序，測序讀長為single-end(SE)50 nt，測序工作由北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。

1.4 已知miRNA的獲取

使用Illumia Solexa高通量測序技術獲得小RNA的原始數據(raw reads)。原始數據包括低質量讀數、污染序列等，需將其清理獲得clean reads序列，使用水稻基因組(Oryza_sativa.IRGSP-1.0)作為參考基因組進行序列比對，最后將比對上參考基因組的reads序列與已知miRNA數據庫miRBase(v22.1)(http://www.mirbase.org/)中的成熟miRNA序列進行比對，與數據庫序列完全相同的reads被認為是已知miRNA。

1.5 差異表達miRNA分析

將0 h-R/S/L分別與24 h-R/S/L、72 h-R/S/L對應的組織比較；24 h- R/S/L分別與72 h-R/S/L對應的組織比較，判斷兩組間已知miRNA表達量是否存在顯著差異，使用R package edgeR軟件[19]進行差異分析。首先對每個樣品中miRNA的read counts數采用TPM計算度量指標(transcript per million)[20]進行歸一化處理，計算統計檢驗的P值，根據P值和log2(fold-change)的值進行篩選。選擇|log2(fold-change)|>1，P值<0.05的miRNA認為是差異表達的miRNA。

1.6 靶基因預測及功能分類

利用psRNA target平臺[21](http://plantgrn.noble.org/psRNA Target)以水稻基因組序列(Oryzasativa, taranscript, RAP-DB, version 1.0，https://rapdb.dna.affrc.go.jp/download/irgsp1.html)為候選靶基因庫，采用默認參數對本實驗中差異表達的miRNA進行靶基因在線預測。然后使用The plant GSEA平臺[22](http://structuralbiology.cau.edu.cn/PlantGSEA/tools.php)對靶基因進行GO(Gene Ontology)分類，可獲得靶基因在與其相對應的mRNA序列中的分類信息。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

挑選24與72 h表達趨勢相同的miRNA進行qRT-PCR驗證，利用Trizol法提取鹽脅迫72 h組和對照組水稻根部總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA第一鏈，之后對miRNA及靶基因進行熒光定量檢測，根據TaKaRa公司的SYBR GreenTMPremixExTaqTM試劑盒說明書配置20 μL反應體系：cDNA模板2 μL，上、下游引物(表1)各0.4 μL，SYBR PremixExTaq(2×)10 μL，ROX Reference Dye (50×)0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。

表1 qRT-PCR所使用引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

反應程序為：預變性94 ℃ 30 s；變性94 ℃ 5 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 45 s，40個循環。每個樣品3個生物學重復，所用引物均為miRNA前體序列特異引物，內參基因使用水稻Osactin2(XM_015759418.2)，由生工生物(上海)有限公司合成。相對表達量計算方法采用2-ΔΔCT方法[23]。

2 結果與分析

2.1 不同組織鹽處理條件下的小RNA高通量測序

為了分析水稻幼苗在高鹽條件處理后表型變化的差異情況，使用濃度為150 mmol·L-1的氯化鈉溶液對二葉期的水稻幼苗進行處理，處理24 h時水稻幼苗出現輕微萎蔫狀態，而72 h時水稻幼苗則表現出了嚴重的萎蔫狀態(圖1)。為了分析表型變化所產生的內在原因，分別對鹽處理24 h和72 h水稻幼苗的根、莖、葉組織進行取樣及小RNA高通量測序。將測序后所產生的原始序列整理，去除低質量序列、過濾核糖體RNA等序列，0 h-R/S/L組分別產生1.91×107、1.69×107和2.45×107條原始序列以及1.40×107、1.24×107和1.49×107條Clean reads；24 h-R/S/L組分別產生1.70×107、1.99×107和2.19×107條原始序列以及1.28×107、1.26×107和9.69×106條Clean reads；72 h-R/S/L組分別產生3.14×107、1.62×107和3.87×107條原始序列以及2.21×107、8.99×106和2.03×107條Clean reads(表2)。

表2 水稻小RNA測序數據Table 2 Summary of small RNA data produced by solexa sequencing from rice

圖1 鹽脅迫水稻幼苗表型差異Fig.1 Phenotype in rice seedling under salt stress

2.2 水稻中小RNA的豐度變化

經150 mmol·L-1鹽處理后，對不同時間點水稻不同組織中小RNA豐度的變化趨勢進行分析，結果(圖2)表明，已知miRNA的表達變化主要分四類：①受到鹽脅迫后，隨著處理時間的延長，水稻幼苗根部、莖部和葉片24 nt小RNA的豐度均呈下降趨勢；②隨著處理時間的延長，根和莖中21 nt的小RNA豐度呈先上升后下降趨勢，而葉片中21 nt小RNA則持續下降；③隨著處理時間的延長，根和葉中30 nt小RNA豐度呈持續上升趨勢，莖中則表現為先下降后上升趨勢；④在0 h-R/S/L組和24 h-R/S/L組中24 nt小RNA含量最高；在72 h-R/S/L組中則21 nt小RNA含量最高。

圖2 不同處理時間內水稻幼苗根、莖和葉中小RNA序列長度分布Fig.2 Length distribution of the sRNAs in rice root, stem and leaf at different treatment time

一般來說，小RNA的長度區間為18～30 nt，miRNA集中在20～23 nt，siRNA(small interfering RNA)集中在20～24 nt，30 nt的小RNA在動物中主要是piRNA(piwi-interacting RNA)，植物中的功能還未見相關報道。

2.3 差異表達的已知miRNA

將測序結果與miRBase數據庫中(http://www.mirbase.org)水稻miRNA序列比對，0 h-R/S/L、24 h-R/S/L和72 h-R/S/L共鑒定出248個已知miRNA，來源于132個miRNA家族。其中來自于29個miRNA家族的51個miRNA在鹽處理后發生顯著的差異表達[|log2(fold-change)|]>1，P值<0.05)。進一步對在不同組織間差異表達miRNA的變化趨勢和表達譜進行分析，為miRNA在高鹽條件下的功能和作用機制的闡明奠定基礎。

2.3.1根部差異表達miRNA 在150 mmol·L-1鹽處理條件下，水稻根部有31個差異表達的miRNA(圖3)，根據差異miRNA表達量隨時間的變化趨勢，將其分為四類。第一類包含6個miRNA：Osa-miR444a-5p、Osa-miR530-5p、Osa-miR1878、Osa-miR5156、Osa-miR5788和Osa-miR5827，它們在24 h內表達量迅速降低，并在24至72 h不再變化；第二類包含17個miRNA：Osa-miR156k、Osa-miR169h、Osa-miR169i-5p.1、Osa-miR169j、Osa-miR169k、Osa-miR169l、Osa-miR169m、Osa-miR396c-5p、Osa-miR396e-5p、Osa-miR396f-5p、Osa-miR397a、Osa-miR397b、Osa-miR408-5p、Osa-miR1425-5p、Osa-miR2871a-5p、Osa-miR2878-5p和Osa-miR11339-5p，它們的表達量在72 h內持續降低；第三類包含5個miRNA：Osa-miR166a-5p、Osa-miR166e-5p、Osa-miR1846d-5p、Osa-miR1850.1和Osa-miR3979-5p，它們的表達量在24 h內迅速升高，在24 h至72 h內逐漸下降；第四類包含3個miRNA：Osa-miR166b-5p、Osa-miR166h-5p和Osa-miR166k-5p，它們的表達量在72 h內逐漸升高。

圖3 鹽脅迫下水稻根中差異表達miRNAFig.3 Differentially expressed miRNA in rice root under salt stress

差異表達的miRNA家族中，Osa-miR166家族和Osa-miR169家族成員中發生變化的成員最多，其中Osa-miR169家族的6個成員表達量下降，而Osa-miR166家族的5個成員表達量升高，推測這兩個家族在根中響應鹽脅迫方面起重要作用。

2.3.2莖部差異表達miRNA 莖部共有11個差異表達的miRNA(圖4)，分為三類。第一類包含2個miRNA：Osa-miR3979-5p和Osa-miR5795，它們在24 h內表達量迅速降低，并在24至72 h不再變化；第二類包含4個miRNA：Osa-miR166h-5p、Osa-miR171d-5p、Osa-miR171e-5p和Osa-miR528-5p，它們的表達量在24 h內迅速升高，在24 h至72 h內逐漸下降；第三類包含5個miRNA：Osa-miR5801a、Osa-miR5801b、Osa-miR814a、Osa-miR814b和Osa-miR814c，它們的表達量在72 h內持續降低。

圖4 鹽脅迫下水稻莖中差異表達miRNAFig.4 Differentially expressed miRNA rice instem under salt stress

對莖部差異表達的miRNA進一步分析發現，隨著處理時間的增加，大部分miRNA的表達量顯著下降，例如Osa-miR5801和Osa-miR814家族成員等；表達量顯著升高的有Osa-miR166h和Osa-miR171家族部分成員等。結合根部分析結果可證實Osa-miR166家族對鹽脅迫強烈響應。

2.3.3葉部差異表達miRNA 葉部共有9個差異表達的miRNA(圖5)，分為四類。第一類包含2個miRNA：Osa-miR5801b、Osa-miR812o-5p，表達量在24 h內迅速降低，在24至72 h內逐漸升高；第二類為Osa-miR2103，表達量在24 h內迅速升高，在24～72 h內逐漸下降；第三類包含5個miRNA：Osa-miR814a、Osa-miR814b、Osa-miR814c、Osa-miR5145、Osa-miR1432-5p，它們的表達量在72 h內迅速降低；第四類為Osa-miR5150-5p，在24 h內表達量迅速降低，并在24至72 h不再變化。葉部差異表達miRNA中，除Osa-miR2103顯著上調表達外，其余均顯著下調表達。

圖5 鹽脅迫下水稻葉中差異表達miRNAFig.5 Differentially expressed miRNA in rice leaf under salt stress

對比地上部與地下部中差異miRNA，發現有3個miRNA在根與莖中表達趨勢不同：Osa-miR3979-5p在根中表達量先升高后降低，在莖中顯著降低；Osa-miR166h-5p在根中表達量顯著升高，在莖中升高后降低；Osa-miR5801b在莖中表達量持續降低，在葉中表現為先降低后升高。Osa-miR814家族的三個成員(Osa-miR814a、Osa-miR814b和Osa-miR814c)在莖與葉中的表達模式相同，均表現為持續降低。 說明同一miRNA在不同組織部位表達量不盡相同。

2.4 miRNA的靶基因預測與GO分類

通過psRNA target靶基因在線預測平臺[21]對本實驗中差異表達的miRNA進行靶基因在線預測，51個差異miRNA預測到592個符合篩選條件的靶基因。差異miRNA的靶基因主要涉及各種生理代謝進程的轉錄因子，如SPL、GRF、SAP、HD-ZIP、NF-YA、Laccase等。

使用The plant GSEA在線富集分析平臺[22]，對靶基因進行GO分類(圖6)，結果表明：差異表達的miRNA所對應的靶基因在細胞組分中顯著富集于膜相關細胞器；在分子功能中顯著富集于核糖核苷酸結合、ATP結合等過程；在生物學過程中，靶基因顯著富集于含氧酸代謝、磷代謝、氮代謝等過程。

圖6 miRNA靶基因GO分類Fig.6 GO classification of known-miRNA target genes

2.5 熒光定量分析差異基因

2.5.1miRNA驗證 為了進一步驗證逆境相關miRNA的表達，使用qRT-PCR方法分析5個在24和72 h內根部表達量趨勢相同的鹽脅迫響應差異miRNA基因(圖7)，分別來源于差異變化倍數較大的miR166家族、miR169家族和miR530家族。結果表明：鹽脅迫72 h水稻幼苗根部Osa-miR166k顯著上調；Osa-miR169h和Osa-miR530略下調；Osa-miR166h略上調，與高通量測序結果一致。但是Osa-miR166b表達略下調，與高通量測序結果相反。

圖7 5個鹽脅迫響應miRNAs相對表達量檢測Fig.7 Detection of relative expression of 5 salt stress responsive miRNAs

2.5.2靶基因驗證 測序結果顯示24 h-R與72 h-R組中Osa-miR169家族成員變化趨勢相同，且Osa-miR169家族在植物生長發育以及抵抗非生物脅迫過程中起到了重要的調節作用，在水稻中，Osa-miR169家族的靶基因NF-YA已有較為深入的研究[24]。挑選由psRNA target[21]平臺在線預測到水稻Osa-miR169h的候選靶基因，對其中4個分值最高的NF-YA家族基因OsNF-YA1(Os03g0174900)、OsNF-YA2(Os03g0411100)、OsNF-YA4(Os03g0696300)和OsNF-YA10(Os12g0618600)進行qRT-PCR分析。結果表明,Osa-miR169h的候選靶基因OsNF-YA4的表達量與對照相比無顯著差異，而OsNF-YA1、OsNF-YA2、OsNF-YA10在受到鹽脅迫72 h水稻根部上調表達，這與Osa-miR169h的表達下調結果相一致。

圖8 4個靶基因相對表達量檢測Fig.8 Detection of relative expression of 4 target genes

3 討論

miRNA在植物中幾乎涉及到生長、發育、代謝調控等各個方面，包括種子萌發[25]、活性氧清除[26]、激素信號轉導[27]、植物器官形態發育[28]以及逆境脅迫應答[29]等。近年來，人們相繼揭示了水稻[30]、擬南芥[31]、苜蓿[32]、玉米[33]等作物鹽脅迫下miRNA的差異表達模式，并探討了相關miRNA在植物鹽脅迫中的調控機制。本研究結果顯示，鹽脅迫下，水稻Osa-miR156k、Osa-miR169h/i/j/k/l/m、Osa-miR396c、Osa-miR396e、Osa-miR396f、Osa-miR408、Osa-miR530、Osa-miR397a、Osa-miR397b表達量下調，這與miR156在棉花[34]、玉米[35]、柳枝稷[36]，miR169、miR396在互花米草[37]，Osa-miR408在水稻[12]、柳枝稷[36]、miR530在毛果楊[38]，miR397在柳枝稷[39]中下調結果一致；而水稻Osa-miR166a在鹽脅迫后表達量下調，這與miR166在擬南芥[40]、玉米[41]中上調表達結果相反。研究還發現，Osa-miR171e、Osa-miR171d在鹽處理后表達量先升高后降低，這與miR171在互花米草中表達量降低結果不完全相同[37]。這說明在不同植物中，miRNA的表達不僅具有時空特異性，其應答鹽脅迫的方式也不盡相同。

本研究發現,差異表達miRNA在根中數量最多，莖中其次，葉中最少，推測其可能與水稻不同部位受到鹽脅迫的接觸方式有關，根系作為水稻直接感受鹽分變化的器官，其對鹽脅迫反應更加敏感。而莖是植物體的中軸部分，具有疏導營養物質和水分的作用，水分通過維管束中的導管到達葉片。在高鹽濃度處理下的植物中的水勢逐漸降低，推測地上部miRNA差異表達可能與水分脅迫有關。

本研究差異表達miRNA的靶基因的預測結果顯示，Osa-miR136、Osa-miR166、Osa-miR169、Osa-miR171、Osa-miR396、Osa-miR397家族的靶基因與其他物種中已經驗證的靶基因相似，其靶基因所編碼的SPL、HD-ZIP、NF-YA、SCL/GRAS、GRL、Laccase作為基因調控的關鍵轉錄因子可能通過控制廣泛的下游基因來響應生物和非生物脅迫。Osa-miR156k的靶基因為SPL轉錄因子[42]，是植物特有的一類基因家族，迄今為止，已發現SPL可調節多個重要的生物過程，如葉片發育[43]、孢子形成[44]、響應GA信號[45]等，在水稻中過表達Osa-miR156導致SPL基因表達降低，繼而影響了在花青素途徑中的DFR基因，最終使得轉基因植株的耐鹽性有所提高[31]。同時，也預測到水稻Osa-miR397a、Osa-miR397b的靶基因Laccase編碼的蛋白有可能與非生物脅迫直接相關。研究表明在低溫條件下，擬南芥中過表達miR397a可增強轉基因植株對低溫脅迫的抗性[46]。Ma等[47]發現，在鹽脅迫下，擬南芥中的miR171作用于靶基因GRAS，通過改變植株根系miRNA的表達情況來抵御鹽脅迫。miR166的靶基因為植物特異性HD-ZIP轉錄因子[48]，包括四個亞家族HD-ZIPⅠ～Ⅳ，其成員通過與其他蛋白互作或者參與激素介導的信號途徑，調控植物的光信號傳導[49]、物質的積累及運輸[50]、逆境應答[51]等生物學過程。對HD-ZIP蛋白的研究表明，HD-ZIPⅠ和Ⅱ亞家族相關基因的表達受ABA、干旱以及鹽脅迫的誘導[52]，如水稻中HD-ZIPⅠ家族OsHOX24基因的啟動子融合OsNAC基因的過表達水稻可提高水稻的耐鹽性及耐旱性[53]，充分說明miR166家族可響應鹽脅迫。miR169的靶基因為NF-YA轉錄因子，前人的研究工作已經證實水稻Osa-miR169家族中Osa-miR169g和Osa-miR169o可強烈響應鹽脅迫[24]，并且在鹽脅迫處理后Osa-miR169在水稻中存在時序性和組織特異性表達[30]，而過表達miR169使得擬南芥抵御干旱和鹽脅迫的能力增強[24]，說明NF-YA在響應干旱及鹽脅迫應答過程中具有重要作用。本研究對Osa-miR169h的靶基因NF-YA家族的四個成員進行轉錄水平qRT-PCR驗證，結果表明,OsNF-YA1、OsNF-YA2、OsNF-YA10在受到鹽脅迫72 h水稻根部上調表達，與Osa-miR169h的表達呈現相反趨勢。但有關這些差異表達miRNA是如何調控其靶基因，它們的靶基因在抗鹽相關通路中的作用機制仍待進一步研究。