云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落多樣性分析

樊帆, 李正濤, 李世鈺,2, 山云輝, 黃家雄,呂玉蘭, 何飛飛, 秦世雯*

(1.云南大學農學院, 昆明 650550; 2.云南省瑞麗市農場管理委員會, 云南 瑞麗 678600; 3.德宏后谷咖啡有限公司, 云南 德宏 678400; 4.云南省農業科學研究院熱帶亞熱帶經濟作物研究所, 云南 保山 678000)

咖啡是全球主要飲料作物之一，具有重要的商業價值。云南熱區具有咖啡種植的最佳海拔高度和氣候條件，種植面積和產量均占全國咖啡的98%以上[1]。目前，云南咖啡產區主要集中在云南保山、德宏、臨滄、普洱等地[2]。隨著云南咖啡產業的快速發展，提高咖啡品質、解決栽培技術落后和加工滯后等問題對發展云南高原特色農業具有重要意義。

咖啡優良品質的形成與咖啡的生產量、施肥、耕作方式和自然環境的動態平衡息息相關[3-4]。土壤微生物是指示種植生態系統的重要指標，在種植土壤發育、有機質轉化、生態系統平衡、土壤環境凈化、生物修復等方面起著不可替代的作用，并且土壤微生物對植物生長和抗逆性具有促進作用。細菌是土壤微生物中數量最大的一個類群，可決定土壤微生物總量的分布、有機物的分解和養分的轉化[5-7]。如落葉松人工防護林土壤微生物中細菌數量直接影響土壤微生物總量的變化趨勢[8]；鎘耐性促生細菌明顯改善了鎘污染土壤微生物環境，促進植物生長[9]。并且土壤中微生物生物量一定程度上代表該生態系統物質循環能力和支持植被生長發育的能力[10]。然而云南咖啡熱區土壤研究主要集中在肥力評價，對土壤微生物的研究還較少[11-13]。

本研究以云南咖啡主產區保山市潞江壩(干熱區)和德宏芒市(濕熱區)不同年限的咖啡種植地紅壤為研究對象，采用高通量測序技術分析其細菌群落結構、細菌種群豐度和多樣性的變化，深入了解云南咖啡種植地紅壤的細菌生態環境，為維持云南熱區咖啡土壤質量和健康、培育優質的咖啡提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

云南熱區是熱帶北緣與南亞熱帶地區的統稱，熱量條件≥10 ℃年積溫6 000 ℃上，年平均氣溫>18 ℃，最冷月平均氣溫>10 ℃，年降雨量600～2 700 mm，干濕季分明，5—10月為雨季，降雨量占全年的86%，11月至翌年4月為干季，降雨量僅占全年的14%，年日可照時數1 750～2 250 h。云南熱區總面積8.1萬 km2左右，占云南省土地總面積的21%，主要分布在瀾滄江、金沙江、怒江、紅河、南盤江以及伊洛瓦底江的支流大盈江、龍江流域海拔1 400 m以下的低熱河谷。熱區是云南自然地理系統的低熱層，是云南巨大的山地系統的組成部分。熱區濕潤-半濕潤區的土壤類型主要是磚紅壤和赤紅壤，半干旱區的土壤類型主要是燥紅壤和褐紅壤，pH范圍為4.1～6.5。

本研究區域位于云南咖啡主產地保山市潞江壩和德宏景頗族自治州芒市。德宏芒市屬于濕潤-半濕潤區，保山潞江壩屬于半干旱區。總的氣候特點為光熱充足，水分缺乏，干濕分明，太陽輻射較強。

1.2 樣品采集

供試土壤采自云南省保山市隆陽區潞江壩和德宏傣族景頗族自治州芒市不同種植年限咖啡園。2017年咖啡采摘結束后，按S形取樣法取10個點作為1個混合樣，每塊樣地重復采集3次，采集深度0～20 cm耕層土壤。土樣磨細過2 mm篩后，保存于-80 ℃備用。供試土壤基本情況見表1。

表1 云南咖啡種植紅壤樣品基本情況Table 1 Summary of the red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

1.3 土壤微生物總DNA提取

采用磁珠法土壤微生物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取樣本的微生物基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(Nanodrop 8 000, USA)檢測DNA的純度和濃度。隨后取適量的DNA樣品稀釋至1 ng·μL-1。

1.4 PCR擴增及測序

利用引物515F/806R擴增細菌16S rDNA基因的V4區域[14]。PCR反應體系30 μL：2×Phusion Master Mix 15 μL，引物3 μL， gDNA 10 μL(5～10 ng)，H2O 2 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環30次；72 ℃延伸5 min。PCR產物質量和濃度通過2%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計進行檢測。隨后PCR產物等質量混樣，充分混勻后利用2%的瓊脂糖膠電泳和GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific，USA)進行純化回收。最后，樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行土壤微生物高通量測序(基于IonS5TMXL測序平臺)。

1.5 數據處理

利用Cutadapt(V1.9.1)[15]對reads進行低質量部分剪切和初步質控得到原始數據(raw reads)，去除嵌合體[16-17]后最終獲得Clean reads。利用Uparse 軟件(v7.0.1001)[18]對所有樣品的全部 Clean reads 進行聚類，默認以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)。對OTUs代表序列進行物種注釋和分類學信息，并分別在各分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)統計各土樣細菌群落組成[19-20]。對各土樣數據進行均一化處理，最后進行α多樣性和β多樣性分析。α多樣性指數組間差異分析和β多樣性指數組間差異分析分別進行Tukey檢驗和wilcox檢驗。

2 結果與分析

2.1 測序質量分析

云南省保山市潞江壩和德宏州芒市不同咖啡種植年限的紅壤細菌16S rDNA擴增子測序結果如表2所示，五個咖啡種植土樣Clean reads數平均為80 167，Clean reads的平均長度為252 bp，90%以上的堿基質量達到Q20水平，表明測序質量良好。

表2 云南熱區咖啡種植地紅壤細菌16S rDNA擴增子測序結果 Table 2 Sequencing quality of 16S rDNA of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

2.2 細菌群落組成和結構分析

2.2.1不同咖啡種植區域紅壤細菌群落結構特征 為研究云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落的多樣性，對所有樣品的Clean reads進行聚類和注釋，五個咖啡種植地紅壤細菌在界、門、綱、目、科、屬、種分類水平下OTUs數目如表3所示。細菌分類學分析結果表明，五個咖啡種植地土樣中共檢測出細菌39門、109綱、145目、276科、458屬。所有土樣中優勢細菌門(相對豐度>1%)為：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門(Firmicutes)(表4)。

表3 云南熱區咖啡種植地紅壤細菌在各分類水平下的OTUs數目Table 3 Number of OTUs of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan at the different classification levels

表4 云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落相對豐度前10菌門的相對豐度Table 4 Relative abundance of the top 10 phylum of red soil bacterial community in coffee-growing regions of tropical Yunnan

另外，5個咖啡種植地土樣的相對豐度前35的菌屬中均存在氨氧化微生物(Ammonia-oxidizingarchaea, AOA)Group I.1 a-associated(CandidatusNitrosotalea)，并且在潞江壩地區豐度較高(0.43%～0.67%)，說明氨氧化古菌(AOA)可能是云南熱區咖啡種植地紅壤的主要氨氧化微生物(圖1)。

注：不同顏色塊代表相對物種豐度值，由藍到紅，相對豐度逐漸升高，只顯示豐度最高的前35個屬。Note：Different color represents the relative species abundance value, and the relative abundance gradually increases from blue to red. Only top 35 genera with the highest abundance are shown.圖1 云南熱區咖啡種植地紅壤在屬水平上的細菌群落的物種豐度聚類Fig.1 Clustering of bacterial community structures of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan at level of genus

潞江壩與芒市咖啡種植區紅壤細菌在群落組成和豐度上均存在明顯差異(圖1和表4)。相對于芒市，潞江壩咖啡種植土樣中的變形菌門(潞江壩平均為37.02%，芒市平均為24.90%)、芽單胞菌門(潞江壩平均為7.06%，芒市為3.09%)、擬桿菌門(潞江壩平均為5.96%，芒市平均為2.37%)，以及厚壁菌門(潞江壩平均為2.69%，芒市平均為1.17%)相對豐度顯著較高，而酸桿菌門(潞江壩平均為13.83%，芒市平均為20.17%)、綠彎菌門(潞江壩平均為2.90%，芒市平均為16.56%)和裝甲菌門(潞江壩平均為0.47%，芒市平均為1.03%)相對豐度顯著較低(表4)。

另外，潞江壩與芒市咖啡種植地紅壤細菌優勢屬(相對豐度>1%)也明顯不同。B5a細菌優勢屬共9個，分別為Mizugakiibacter(8.54%)、Rhizomicrobium(2.34%)、Gemmatimonas(2.7%)、Rhodococcus(1.89%)、Bryobacter(1.67%)、RB41(1.40%)、Nocardioides(1.00%)、Sphingomonas(3.32%)、unidentified_Mitochondria(1.11%)；B8a細菌優勢屬共8個，分別為Mizugakiibacter(8.97%)、Rhizomicrobium(3.12%)、Gemmatimonas(3.01%)、Bryobacter(1.71%)、RB41(1.30%)、Sphingomonas(2.94%)、unidentified_Mitochondria(1.51%)、Granulicella(1.07%)。而M2013細菌優勢屬共11個，分別為Blastococcus(1.12%)、unidentified_TK10(2.25%)、Gemmatimonas(1.33%)、Rhodanobacter(1.14%)、Bryobacter(2.86%)、Bradyrhizobium(1.78%)、Arthrobacter(1.32%)、CandidatusSolibacter(2.37%)、Sphingomonas(1.26%)、Acidothermus(1.75%)、Anaeromyxobacter(1.24%)；M6a細菌優勢屬共11個，分別為Mizugakiibacter(1.73%)、Rhizomicrobium(1.80%)、Actinospica(1.04%)、Bryobacter(3.18%)、Bradyrhizobium(1.73%)、BurkholderiaParaburkholderia(1.11%)、Arthrobacter(1.70%)、CandidatusSolibacter(2.13%)、Pseudarthrobacter(1.07%)、Acidibacter(1.33%)、Acidothermus(4.63%)；M6a細菌優勢屬共8個，分別為Rhizomicrobium(2.01%)、Bryobacter(2.21%)、Bradyrhizobium(2.20%)、BurkholderiaParaburkholderia(2.56%)、CandidatusSolibacter(2.31%)、Crossiella(1.01%)、Acidothermus(2.95%)、Variibacter(1.24%)。

2.2.2不同咖啡種植年限紅壤細菌群落結構特征 隨咖啡種植年限增加，潞江壩咖啡種植地土樣中放線菌門的相對豐度減少了3.25%；芒市咖啡種植地土樣中變形菌門的相對豐度提高了5.58%，而綠彎菌門和芽單胞菌門的相對豐度分別減少了5.94%和1.01%；另外，放線菌門(20.20%)的相對豐度在M6a土樣中豐度最高，而浮霉菌門(4.85%)和疣微菌門(4.30%)在M20a樣品中豐度最高(表4)。

2.2.3云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落結構的主成分分析 為了解潞江壩和芒市不同咖啡種植年限的紅壤細菌群落結構差異，對其進行了基于OUT水平的主成分分析(PCA)，提取出最大程度反映樣品間差異的兩個主成分，貢獻率分別為28.34%和15.96%。潞江壩和芒市的不同土樣圍繞PC1軸分開，潞江壩B5a和B8a分布在PC1的負軸，芒市M2013、M6a和M20a分布在PC1的正軸，說明云南干熱區和濕熱區的咖啡種植地紅壤細菌群落結構差異明顯(圖2)。另外，潞江壩B5a與B8a的細菌群落結構無明顯差異，均分布在PC2負軸；而芒市M2013和M6a與M20a的細菌群落結構差異明顯，M2013和M6a分布在PC2正軸，而M20a分布在PC2負軸(圖2)。

圖2 云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落PCA分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of bacterial community composition of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

2.3 云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落的多樣性分析

潞江壩B5a和B8a的細菌種類數目、豐富度(chao1和ACE指數)均比芒市M2013和M6a多，但與M20a無顯著差異，說明潞江壩咖啡種植8 a后和芒市20 a后紅壤細菌種類數目和豐富度無明顯差異，且在潞江壩咖啡種植8 a內和芒市咖啡種植6 a內并不能顯著提高紅壤細菌種類數目和豐富度(表5)。潞江壩B5a與B8a的多樣性指數shannon無顯著差異，但與M20a差異顯著；而芒市紅壤細菌多樣性指數shannon隨著咖啡種植年限的增加而提高(表5)。另外，潞江壩B5a與B8a的多樣性指數simpson無顯著差異，但與芒市3個咖啡種植地土樣差異顯著；芒市紅壤細菌多樣性指數simpson隨著咖啡種植年限的增加并無顯著提高(表5)。以上結果表明，咖啡種植年限增長對云南熱區紅壤細菌群落的豐富度和多樣性無明顯提高。

表5 云南熱區咖啡種植地紅壤細菌群落的α多樣性指數Table 5 Bacterial diversity indexes of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

3 討論

微生物類群數量是靈敏指示土壤環境質量變化的生物學指標之一，反映了土壤環境生態功能的演變規律[21]。云南保山市潞江壩和德宏芒市是云南主要咖啡種植區，其紅壤優勢細菌主要為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門和厚壁菌門。本研究結果與稻田紅壤和有機農田紅壤的根際土壤細菌群落研究結果相似[22-24]。目前研究表明，氨氧化古菌(AOA)傾向于在酸性和低氮的寡營養環境中起作用，而紅壤酸性強、有機質含量低、養分匱乏，因此,AOA在紅壤細菌中主導氨氧化作用[25-27]。本研究發現，在潞江壩和芒市咖啡種植地紅壤中AOA豐度顯著高于其他氨氧化細菌，可能是云南熱區咖啡種植地紅壤的關鍵氨氧化微生物。另外，2個咖啡種植地的紅壤中均發現有利于咖啡生長的優勢菌屬，如Sphingomonas(降解化學殺蟲劑)[28]，Blastococcus(抵御不良環境、防治土壤病害)[29]，Arthrobacter、Acidothermus、Bryobacter和CandidatusSolibacter(分解有機質，促進土壤碳循環)[30-33]。因此，研究云南熱區咖啡種植紅壤的細菌類群及其作用，將為保持云南咖啡生態系統平衡，促進云南咖啡產業的可持續發展提供重要參考。

咖啡種植年限低于8 a，保山潞江壩相對于芒市咖啡種植地的紅壤細菌種類多，并且細菌豐富度也較高，說明云南干熱區相較于濕熱區可能更有利于紅壤細菌的生長。這可能與不同熱區的海拔維度、氣候條件、土壤含水量、土壤肥力、咖啡根系生物量、農業管理措施等因素密切相關。土壤微生物的生態系統復雜，并且時刻處于動態平衡的變化過程中，影響云南熱區土壤微生物數量變化的主控因子還有待深入研究。

另外，不同咖啡種植年限下云南熱區咖啡種植地紅壤細菌在群落組成和豐度存在一定差異。隨咖啡種植年限增加，潞江壩或芒市咖啡種植地紅壤一些細菌優勢屬發生了變化，并且芒市咖啡種植地的紅壤細菌群落組成相對潞江壩變化較大，但2個區域咖啡種植地紅壤細菌群落的豐富度和多樣性并無明顯提高。目前不同種植年限下紅壤微生物多樣性研究還較少，有的研究發現土壤微生物數量和多樣性隨著種植年限的增加而增多[34-35]，有的研究結果卻不同[36-39]。這可能與土壤采樣時間、采樣深度、采樣點肥力差異等有關，特別是與土壤的最高種植年限密切相關。最高種植年限不同，土壤的結構、通氣性、水分狀況、養分等理化性狀均會發生變化，因而對土壤微生物多樣性產生了重要影響。