新疆焉耆縣不同動物源耐藥沙門氏菌的MLST分析

王凱, 林亞軍, 王舒豐, 李淑嫻, 向志宇, 夏利寧

(新疆農業大學動物醫學學院, 烏魯木齊 830052)

沙門氏菌(Salmonella)因其抗原性復雜、血清型多樣以及臨床表現和病理變化多，且能夠同其他病毒與細菌產生并發性疾病，導致畜牧養殖業出現嚴重的經濟損失[1]。由沙門氏菌造成的食物中毒和食源性疾病案例在國內外一直排名前列[2]。抗菌藥物是目前治療沙門氏菌病的有效手段，但隨著其在臨床的普遍使用，甚至濫用，造成沙門氏菌耐藥菌株數量不斷增加以及多重耐藥菌株陸續出現，沙門氏菌耐藥問題日漸嚴重，為畜牧養殖業的良好發展與人類的身心健康帶來潛在威脅[3]。

新疆為少數民族居住地，養殖業發達，以牛、羊養殖為主，豬、禽養殖為輔。焉耆縣位于新疆維吾爾自治區中部，共有23個民族寄居在此。隨著多民族聚居，導致其對動物性食品種類的需求多樣化，故焉耆縣有著豐富的畜牧養殖資源。由于人們生活水平的提高，對肉類的食用量也呈上升趨勢，隨之由食品動物源耐藥菌傳播給人類的風險也逐漸增大，卻鮮見對新疆不同動物源沙門氏菌耐藥的相關研究。多位點序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)是近年來發展起來的一種新型的分子分型方法，用于親緣性關系分析。本研究通過對新疆焉耆縣不同動物糞源分離的沙門氏菌進行藥敏試驗及相關耐藥基因檢測，分析耐藥表型與攜帶的耐藥基因之間的關系；并通過MLST方法分析不同動物源沙門氏菌之間的親緣關系。本研究一方面可為焉耆縣被檢養殖場提供科學的臨床用藥方案，另一方面也為該縣動物源沙門氏菌耐藥庫的建設提供數據，為今后開展動物源細菌耐藥性風險評估提供理論依據。親緣關系分析也為進一步研究沙門氏菌耐藥傳播機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1樣品 2016年7月于新疆焉耆縣部分規模化養殖場使用滅菌肛拭子在動物直腸進行不同動物源新鮮糞樣樣品采集，共采集樣品1 147份，其中牛源糞樣97份、雞源糞樣400份、羊源糞樣250份以及豬源糞樣400份。

1.1.2標準質控菌株與培養基 Mueller-Hinton(MH)培養基、麥康凱瓊脂培養基、氯化鎂孔雀綠增菌液(MM)、沙門氏菌顯色培養基、SS瓊脂培養基均購自奧博星生物技術有限公司(北京)；大腸埃希標準質控菌(ATCC25922)購自天和微生物試劑有限公司(杭州)。

1.1.3藥敏試驗所用藥品 喹諾酮類：環丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、諾氟沙星(norfloxacin，NOF)和恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)；β-內酰胺類：阿莫西林(amoxicillin，AML)、頭孢噻呋(ceftiofur，CEF)和氨芐西林(ampicillin，AMP)；氨基糖苷類：安普霉素(apramycin，APR)、阿米卡星(amikacin，AMK)、慶大霉素(gentamicin，GEN)和卡那霉素(kanamycin，KANA)；四環素類：四環素(tetracycline，TE)；酰胺醇類：氟苯尼考(florfenicol，FLR)；多肽類：多黏菌素(polymyxin，CL)。上述藥品的標準品均購自中國獸藥監察所。

1.2 試驗方法

1.2.1沙門氏菌的分離鑒定 將采集的肛拭子放入裝有1 mL滅菌肉湯的2 mL EP管里，從EP里吸取50 μL樣品至1 mL滅菌MM增菌液中，37 ℃培養12 h后用滅菌接種環在SS瓊脂培養基上劃線培養，37 ℃恒溫培養18～24 h后，挑取中間黑色周圍透明的單菌落至1 mL MM增菌液中，培養12 h后在沙門氏菌顯色培養基上劃線，37 ℃恒溫培養18～24 h，培養基上有紫紅色菌落長出，可初步鑒定為沙門氏菌，之后挑取單菌落保存備用。

對初步鑒定為沙門氏菌的菌株通過PCR檢測沙門氏菌持家基因invA，根據是否檢出invA基因來鑒定沙門氏菌[4]。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。PCR擴增反應體系25 μL，包括ddH2O 9.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、1 μL模板。PCR反應程序見表2。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2沙門氏菌的藥敏試驗及其判定 采用瓊脂稀釋法，對分離鑒定出的沙門氏菌進行上述6類13種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MICs)的測定，測定結果以3種形式記錄：敏感、中介和耐藥，結果判定參照CLSI標準[5]。

1.2.3耐藥基因合成及序列分型 參考文獻[6-16],委托生物工程股份有限公司(上海)分別合成β-內酰胺酶基因(blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA和blaCMY-2)、擴增PMQR因子(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四環素類基因(tetA和tetB)、氨基糖苷類基因[armA、rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia]、酰胺醇類基因(floR)和多肽類基因(mcr-1)的引物(表1)。對檢測出耐藥的沙門氏菌分別進行上述基因的PCR檢測，反應運行參數詳見表2。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統進行拍照分析，將目的片段進行膠回收并送至生物工程股份有限公司(上海)測序，比對后確定基因型。進一步用BstF5Ⅰ酶進行酶切已檢出aac(6′)-Ib基因的PCR產物，如果存在-cr突變情況，那么aac(6′)-Ib基因將失去BstF5 I酶的限制性位點并出現不能被切割現象。再次通過觀察瓊脂糖凝膠電泳圖譜的條帶可以得知aac(6′)-Ib基因中-cr有無突變現象。

表1 本研究所用PCR引物序列

表2 PCR反應運行參數

1.2.4MLST分析 根據不同動物源樣品的分離率，分別從焉耆縣雞源、牛源、羊源和豬源沙門氏菌中挑取多藥耐藥且攜帶多種耐藥基因的8株菌，其中雞源沙門氏菌3株，牛源沙門氏菌2株，羊源沙門氏菌1株和豬源沙門氏菌2株。

參照MLST網站(http://www.mlst.net)選擇沙門氏菌的7個管家基因。根據Kidgell等[17]合成thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD和dnaN共7對擴增引物，引物序列詳見表1，擴增引物均委托生物工程股份有限公司(上海)合成。用MEGA6軟件將測序結果進行剪切，將序列中用于分型部分序列提交至上述的MLST網站數據庫中進行等位基因對比，得到相應的等位基因編號，之后把等位基因圖譜輸入Hps MLST數據庫，按照指定排列順序形成ST(sequence type)型[18-20]。等位基因的不同直接決定菌株的ST型不同，比較菌株的ST型即可得知菌株間的親緣性關系，最后利用DNA star的MegAlign功能對不同菌株序列構建核苷酸序列比較圖，利用Mega構建進化樹。

1.2.5數據分析 耐藥率結果與多藥耐藥結果采用SPSS 17.0軟件進行卡方檢驗做差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 不同動物源沙門氏菌分離鑒定

共分離沙門氏菌230株，分離率為20.1%(230/1 147)。其中牛糞源沙門氏菌分離率為64.9%(63/97),雞糞源沙門氏菌分離率為27.5%(110/400),豬糞源沙門氏菌分離率為10.0%(40/400),羊糞源沙門氏菌分離率為6.8%(17/250)。

2.2 不同動物源沙門氏菌的耐藥結果

由圖1可知新疆焉耆縣不同動物源沙門氏菌的整體耐藥嚴重程度由高到低依次為牛源>豬源>羊源>雞源。不同動物源沙門氏菌對頭孢噻呋、阿米卡星和多黏菌素均高度敏感，無耐藥株檢出，但對其他被檢抗菌藥物均有不同程度耐藥。牛源沙門氏菌對氟苯尼考(55.6%)、氨芐西林(50.8%)和卡那霉素(50.8%)耐藥率均超過50%，對諾氟沙星(49.2%)、四環素(46.0%)、環丙沙星(44.4%)和阿莫西林/克拉維酸(44.4%)的耐藥率超過40%，對安普霉素耐藥率僅為1.6%；豬源沙門氏菌對四環素(55.0%)和氨芐西林(50.0%)兩種抗菌藥物耐藥率超過50%，對阿莫西林/克拉維酸(40.0%)和氟苯尼考(40.0%)耐藥率超過40%，對其他被檢抗菌藥物耐藥率均未超過25%；雞源沙門氏菌對氟苯尼考(19.1%)、氨芐西林(17.3%)、諾氟沙星(16.4%)、阿莫西林/克拉維酸(15.5%)、四環素(13.6%)、卡那霉素(12.7%)、環丙沙星(11.8%)和恩諾沙星(7.3%)的耐藥率在7.3%～19.1%之間，對其他被檢抗菌藥物未檢出耐藥菌株。

注：不同字母表示不同動物源沙門氏菌對同種抗菌藥物耐藥性差異在P<0.05水平具有統計學意義。

牛源沙門氏菌對環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星的耐藥率顯著高于其他三種動物源(P<0.05)；對阿莫西林/克拉維酸與四環素耐藥率顯著高于雞源與羊源沙門氏菌(P<0.05)；豬源沙門氏菌對阿莫西林/克拉維酸耐藥率顯著高于雞源和羊源耐藥率(11.8%)(P<0.05),而對安普霉素耐藥率顯著高于牛源與羊源沙門氏菌(P<0.05)；而雞源與羊源沙門氏菌對試驗中的抗菌藥物的耐藥率差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同動物源沙門氏菌多藥耐藥結果

由圖2可知，不同動物源沙門氏菌多藥耐藥結果以0耐為主，即對被檢藥物均不耐藥。其中，牛源沙門氏菌多藥耐藥以0耐(33.3%)和7耐(對被檢藥物中的任意7種藥物耐藥)(33.3%)為主，除5耐和8耐外，均有分布；豬源沙門氏菌以0耐(32.5%)和6耐(17.5%)為主，在0耐～7耐均有分布；羊源沙門氏菌多藥耐藥以0耐(58.8%)和4耐(23.5%)為主，1耐、3耐和6耐也有分布；雞源沙門氏菌以0耐(72.7%)為主，在0耐～8耐均有分布。表明焉耆縣不同動物源沙門氏菌多藥耐藥情況較為嚴重，應在臨床用藥時替換已經產生耐藥的抗菌藥物，選擇敏感藥物進行治療，以便達到較好的治療效果。

注：不同字母表示不同動物源沙門氏菌的多藥耐藥差異在P<0.05水平具有統計學意義。

牛源沙門氏菌7耐菌株數顯著高于其他3種動物源(P<0.05)；且牛源、羊源、豬源沙門氏菌6耐菌株數均顯著高于雞源(P<0.05)；羊源沙門氏菌4耐菌株數顯著高于牛源和雞源(0.0%)(P<0.05);而羊源與豬源沙門氏菌多藥耐藥結果差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同動物源沙門氏菌耐藥基因檢測結果

由耐藥基因檢測結果(表3)可知，焉耆縣不同動物源沙門氏菌均攜帶β-內酰胺酶基因、PMQR因子、氨基糖苷類基因、四環素類基因和酰胺醇類基因，其中β-內酰胺酶基因以blaTEM(牛源87.3%、羊源41.2%、雞源19.1%和豬源12.5%)和blaOXA(牛源42.9%、羊源23.5%、雞源19.1%和豬源15.0%)為主；PMQR因子以oqxA(牛源44.4%、羊源29.4%、雞源19.1%和豬源15.0%)、oqxB(牛源42.9%、羊源29.4%、雞源19.1%和豬源15.0%)和aac(6′)-Ib-cr(牛源44.4%、羊源23.5%、雞源20.0%和豬源20.0%)為主；氨基糖苷類基因以ant(3″)-Ia(牛源44.4%、羊源29.4%、雞源19.1%和豬源22.5%)和aadA2(牛源44.4%、羊源29.4%、雞源19.1%和豬源10.0%)為主；四環素類基因以tetB(牛源46.0%、羊源41.2%、雞源19.1%和豬源20.0%)為主；酰胺醇類基因以floR(牛源44.4%、羊源23.5%、雞源16.4%和豬源32.5%)為主。此外，豬源沙門氏菌還檢出blaCMY-2(15.0%)、qnrB(5.0%)、qnrS(12.5%)、tetA(15.0%)。而不同動物源分離的沙門氏菌均未檢出基因blaSHV、blaKPC、blaLAP-1、blaCTX-M、armA、rmtB、qnrA、qnrC、qnrD和mcr-1。

表3 焉耆縣不同動物源沙門氏菌耐藥基因檢測結果

牛源沙門氏菌的耐藥基因攜帶率明顯高于其他3種動物源沙門氏菌，牛源菌對blaTEM(87.3%)檢出率超過85.0%，對blaOXA(42.9%)、aadA2(44.4%)、ant(3″)-Ia(44.4%)、oqxA(44.4%)、oqxB(42.9%)、aac(6′)-Ib(44.4%)、tetB(46.0%)和floR(44.4%)的檢出率也超過40.0%。分析原因可能在牛沙門氏菌病臨床用藥過程中β-內酰胺類藥物使用過度，導致牛源沙門氏菌β-內酰胺酶基因檢出率過高，其次對喹諾酮類藥物、四環素類藥物以及酰胺醇類藥物的使用不當造成PMQR因子、四環素類基因以及酰胺醇類耐藥基因檢出率較高。

2.5 不同動物源沙門氏菌多種耐藥基因共存情況

對不同動物源分離的沙門氏菌進行多種耐藥基因共存情況統計，結果(表4)可知，被檢的110株雞源沙門氏菌共有5種耐藥基因共存類型，以blaTEM+blaOXA+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR為主，占15.5%(17/110)；63株牛源沙門氏菌共有6種耐藥基因共存類型，以blaTEM+blaOXA+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR為主，占33.3%(21/63)；17株羊源沙門氏菌共有3種耐藥基因共存類型，以blaTEM+blaOXA+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR為主，占23.5%(4/17)；40株豬源沙門氏菌共有10種耐藥基因共存類型，以blaOXA+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR(12.5%，5/40)為主。

表4 不同動物源沙門氏菌多種耐藥基因共存情況

可見，除豬源沙門氏菌外，不同動物源沙門氏菌均有部分菌株同時攜帶5類耐藥基因，并且雞源(15.5%，17/110)、牛源(33.3%，21/63)和羊源(23.5%，4/17)沙門氏菌耐藥基因共存類型均以blaTEM+blaOXA+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR為主，而豬源沙門氏菌以blaOXA+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr+aadA2+ant(3″)-Ia+tetB+floR(12.5%，5/40)基因共存類型為主，分析原因可能是焉耆縣規模化養殖場存在攜帶多藥耐藥基因的優勢耐藥菌株，其攜帶的耐藥基因可以通過水平或垂直傳播，進而使養殖場內出現大量攜帶相同耐藥基因的耐藥菌株。

2.6 不同動物源沙門氏菌MLST分析結果

從分離鑒定的230株不同動物源沙門氏菌挑選8株用于MLST試驗，所挑選耐藥株的來源、耐藥表型及耐藥基因攜帶耐藥情況見表5。

表5 MLST試驗菌株背景

8株沙門氏菌MLST分型結果(表6)可知，不同動物源分離的沙門氏菌屬于同一種ST型，即ST34,表明這8株沙門氏菌可能來源于同一克隆群，一方面說明焉耆地區沙門氏菌MLST分型以ST34為主，另一方面也說明焉耆地區沙門氏菌菌株具有在不同動物間和/或相同動物間進行傳播的可能性，即在同一地區分離的不同動物源耐藥沙門氏菌可能存在種間和/或種內克隆傳播的耐藥傳播機制。

表6 焉耆縣不同動物源沙門氏菌等位基因情況

2.7 8株沙門氏菌進化樹結果

對8株不同動物源分離的沙門氏菌進行進化樹比較，以此來分析不同動物源沙門氏菌的親緣關系，不同動物源分離的沙門氏菌同源性高達99.7%及以上。進化樹如圖3所示，可以看出，J2與J3親緣性關系較近；N1與Z1親緣關系較近，而Y1與其他7株沙門氏菌親緣關系相對較遠；8株不同動物源分離的沙門氏菌親緣關系較近。

圖3 8株沙門氏菌核苷酸序列進化樹分析

3 討論

牛源沙門氏菌對氟苯尼考的耐藥率最高(55.6%)，略高于趙俊利等[21]對氟苯尼考耐藥率(42.1%)的報道。分析原因可能是牛為焉耆縣常見大型家畜，而夏季是沙門氏菌的高發期。因此,本研究出現低采樣率而沙門氏菌分離率高的現象，而在應對牛沙門氏菌病時，養殖人員可能運用過多種抗菌藥物進行治療，從而導致牛源沙門氏菌耐藥情況最嚴重。牛源沙門氏菌對氨芐西林和卡那霉素的耐藥率均為50.8%，遠低于趙俊利等[21]的報道，可能是因為用藥習慣的不同所致。豬源沙門氏菌對四環素的耐藥率為55.0%，低于支威等[22]的報道(75.0%)；對氨芐西林的耐藥率(50.0%)低于曹正花等[23]的報道(80.7%)，但高于王偉等[24]和杜雄偉等[25]的報道(20.0%和6.7%)；可能是因為不同地區與不同飼養環境造成。豬源沙門氏菌對本研究抗菌藥物耐藥率高于羊源和雞源沙門氏菌，可能是因為規模化養殖下，為降低豬只的發病率，會在飼養過程中使用帶有抗菌藥物的飼料對豬只飼喂；此外，治療細菌病時用藥多樣，導致豬源沙門氏菌耐藥率較高且耐藥譜型多樣化。采集的250份羊糞源樣品中僅分離出17株沙門氏菌，對氟苯尼考和四環素耐藥率均為35.3%，遠低于江萍等[26]對氟苯尼考耐藥率(92.3%)和四環素耐藥率(90.4%)的報道，可能與所采集的羊本身健康狀況及養殖場的用藥差異有關。由于鮮見對羊源沙門氏菌耐藥性相關報道，研究結果可為羊源沙門氏菌的研究提供數據參考。而雞源沙門氏菌耐藥情況并不嚴重，對氟苯尼考的耐藥率最高，僅為19.1%，低于彭斌等[27]的報道(25.0%)；對氨芐西林的耐藥率(17.3%)遠低于其他研究[27-30]報道。雞源沙門氏菌對被檢藥物的耐藥率低的原因，還需要結合用藥調研及與飼養場養殖模式進一步分析。

本研究中，4種動物源均檢測出β-內酰胺酶耐藥基因、PMQR因子、氨基糖苷類耐藥基因、四環素類耐藥基因和酰胺醇類耐藥基因，β-內酰胺酶耐藥基因以blaTEM和blaOXA基因為主；PMQR因子以oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib-cr基因為主；氨基糖苷類耐藥基因以ant(3″)-Ia和aadA2基因為主；四環素類耐藥基因以tetB基因為主；酰胺醇類耐藥基因以floR基因為主。此結果與申永秀等[31]報道的結果(以攜帶基因blaTEM、tetA為主)不同，可能是由于地域不同，臨床用藥差異導致。PMQR因子在4種動物源中的檢出率雖然不高(5.0%～44.4%)，但是PMQR基因的流行可以促進編碼DNA促旋酶的gyrA和gyrB基因突變，及編碼拓撲異構酶Ⅳ的parC和parE基因突變，從而引起高水平的耐藥性[32-33]。本研究中不同動物源沙門氏菌的耐藥表型及對應的耐藥基因檢出率不高，遠低于羅永乾[34]的報道，可能是由于焉耆地區養殖密度遠低于其他地區，臨床用藥較少，所以整體耐藥情況不嚴重。造成不同動物源耐藥情況不同，耐藥基因檢出率有差異可能是由于養殖場技術人員在進行沙門氏菌病的治療時，不同養殖場用藥背景和用藥習慣不同造成。

本研究發現焉耆地區沙門氏菌MLST分型以ST34為主，與陳健皓[35]和劉慧玲等[36]的研究結果不同，與趙翠等[37]報道的濰坊與煙臺豬源沙門氏菌的MLST分型結果一致。表明雖然不同地區用藥情況不同，但卻有可能獲得相同的MLST分型，具體耐藥傳播機制及MLST分型形成原因有待進一步研究。