PCR 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)在孕婦B族鏈球菌感染中的意義

毛穎佳，李連友，于浩，王曉紅

(內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古自治區(qū) 赤峰)

0 引言

B族鏈球菌（group B streptococcus，GBS）是兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，為條件致病菌,寄生于人類下消化道、泌尿生殖道，是圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一[1]。國(guó)外研究報(bào)道，非洲孕婦帶菌率最高，約22.4%，美洲為19.7%、歐洲為19%[2]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，孕婦GBS帶菌率約10.1%～32.4%[3]。GBS 生殖道感染對(duì)孕婦及新生兒的危害性大，可引起胎膜早破、早產(chǎn)、和新生兒感染等[4]。本研究通過(guò)應(yīng)用細(xì)菌培養(yǎng)法及GBS DNA PCR 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法對(duì)孕28-36周孕婦進(jìn)行GBS檢測(cè)，研究GBS帶菌對(duì)妊娠結(jié)局的影響及PCR實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法在GBS檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

2018 年1月至2019 年1 月來(lái)我院產(chǎn)科產(chǎn)檢的孕婦行 B 族鏈球菌感染檢測(cè)的孕婦1852例， 孕婦年齡 19-42歲;初產(chǎn)婦912例，經(jīng)產(chǎn)婦 940例;孕周為 28-36w。所有孕婦孕周均經(jīng)末次月經(jīng)、早中孕期B超檢查進(jìn)行確認(rèn)和核對(duì)，近期無(wú)性交及抗生素應(yīng)用史。

1.2方法

1.2.1 取材

根據(jù)2010年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦的取材方法[5]，擦去外陰的分泌物，用一根無(wú)菌陰道棉拭子放入陰道下1/3旋轉(zhuǎn)一周取陰道分泌物，另外一根棉拭子插入肛門，在肛門括約肌上2-3cm處輕旋得直腸分泌物。每例孕婦用兩根拭子取材作為一份標(biāo)本，每例孕婦采集兩份標(biāo)本分別進(jìn)行GBS培養(yǎng)及GBS DNA PCR 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。

1.2.2 研究方法

（1）GBS培養(yǎng)：將每份標(biāo)本接種到 5% 羊血脂平板，置5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 ～48 h，挑取β溶血的可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，做涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢，鏡下形態(tài)為革蘭陽(yáng)性球菌，呈鏈狀排列，觸酶試驗(yàn)陰性確定為鏈球菌屬，GBS陽(yáng)性。

（2）GBS DNA 檢測(cè)：采用PCR實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè) GBS DNA，試劑盒采購(gòu)來(lái)自北京博爾誠(chéng)有限公司，使用儀器為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品（實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增儀C1000型），檢測(cè)體系及判讀方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

（3）觀察指標(biāo)：以GBS培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算 GBS DNA 檢測(cè)的靈敏性和特異性，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)探討孕婦GBS陽(yáng)性率與妊娠結(jié)局及其所生新生兒的結(jié)局。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GBS培養(yǎng)陽(yáng)性孕婦共156例，陽(yáng)性率為8.42%（156/1852），以 GBS 培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出GBS DNA 檢測(cè)的靈敏性為 93.4%（156/167），特異性為99.3%（1673/1685），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 92.9%（156/168）和陰性預(yù)測(cè)值為99.3%（1673/1684）。見表 1。

表1 GBS培養(yǎng)和GBS DNA 檢測(cè)的靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值

2.2 GBS培養(yǎng)陽(yáng)性孕婦共156例做為實(shí)驗(yàn)組，選取同時(shí)期GBS培養(yǎng)陰性孕婦156例做為對(duì)照組，比較兩組的妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局，結(jié)果顯示GBS陽(yáng)性組在剖宮產(chǎn)率、產(chǎn)后出血、胎膜早破、新生兒GBS感染率及新生兒黃疸發(fā)生率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2及表3。

表2 GBS陽(yáng)性孕婦與GBS陰性孕婦妊娠結(jié)局比較（例/%）

表3 GBS陽(yáng)性孕婦與GBS陰性孕婦的新生兒結(jié)局比較（例/%）

3 討論

GBS 是革蘭氏陽(yáng)性球菌，為圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一。孕婦GBS帶菌率因國(guó)家、 地區(qū)、人種不同而不同。國(guó)外研究報(bào)道，非洲帶菌率最高，約22.4%，美洲19.7%、歐洲19%[6]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，孕婦GBS帶菌率約10.1%～32.4%[3]。本研究結(jié)果顯示孕婦GBS帶菌率為8.42%，本研究孕婦GBS帶菌率在年齡、產(chǎn)次、流產(chǎn)史等兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)35-37周妊娠晚期孕婦GBS帶菌率在初產(chǎn)婦明顯高于經(jīng)產(chǎn)婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。國(guó)內(nèi)外研究均證明，孕婦GBS感染可引起磷酸酯酶A2、前列腺素、細(xì)胞因子等的釋放，刺激子宮收縮，導(dǎo)致早產(chǎn)[8]。我國(guó)早產(chǎn)發(fā)生率約7%～8%，本研究GBS陽(yáng)性孕婦組早產(chǎn)發(fā)生率為7.69%，GBS陰性組發(fā)生率為3.85%，提示GBS陽(yáng)性孕婦組與GBS陰性組在早產(chǎn)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與病例數(shù)少有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。GBS寄生于下消化道、泌尿道、陰道、宮頸，上行性感染胎膜，通過(guò)炎癥細(xì)胞吞噬作用、細(xì)菌磷酸酯酶A2的直接侵襲，使局部胎膜張力減低，導(dǎo)致孕婦在分娩前或分娩時(shí)發(fā)生胎膜早破現(xiàn)象[9]。GBS感染后細(xì)胞角蛋白表達(dá)下降并發(fā)生功能障礙，羊膜上皮細(xì)胞中間纖維網(wǎng)架發(fā)生擾動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性被破壞，影響組織抗拉強(qiáng)度，這表明了孕婦GBS感染與胎膜早破的感染密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示GBS陽(yáng)性組胎膜早破發(fā)生率為26.28%，GBS陰性組發(fā)生率為11.54%，GBS陽(yáng)性組胎膜早破發(fā)生率明顯高于GBS陰性組。B組鏈球菌病（GBS）是新生兒出生后第一周最常見的感染性疾病。新生兒感染GBS的發(fā)病率和死亡率顯著高于正常新生兒，GBS病是影響新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎的重要因素。在臺(tái)灣，孕婦在產(chǎn)道攜帶GBS的患病率約為20%，GBS相關(guān)疾病的新生兒發(fā)病率約為0.1%，GBS相關(guān)疾病的新生兒死亡率在10%至13%之間，與GBS感染相關(guān)神經(jīng)后遺癥的患病率為15%[11]。本研究結(jié)果顯示GBS陽(yáng)性組新生兒GBS感染率高于對(duì)照組，與國(guó)內(nèi)外研究相符，證實(shí)了GBS定植對(duì)孕產(chǎn)婦及新生兒均可造成不良影響。因此，臨床應(yīng)當(dāng)尤其重視GBS的篩查，將GBS篩查作為常規(guī)項(xiàng)目，普及GBS篩查，盡早進(jìn)行預(yù)防，避免不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，減少GBS相關(guān)疾病的發(fā)生。

GBS檢測(cè)方法主要有免疫學(xué)、培養(yǎng)法和PCR法[12]。免疫學(xué)法既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體，檢測(cè)迅速，但因其敏感性和特異性稍低，近年來(lái)臨床應(yīng)用逐漸減少。培養(yǎng)法一直被認(rèn)為是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)難度高，靈敏度有限，假陰性率高，漏診率高，且耗時(shí)長(zhǎng)，因此在臨床檢測(cè)中造成一定的局限性[13]。近年來(lái)，PCR實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越多，其具有快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，PCR法是一種快速且高效的病原微生物檢測(cè)的方法，可通過(guò)對(duì)不同種屬特異性核算序列設(shè)計(jì)引物及不同熒光染料標(biāo)記探針的應(yīng)用，在高通量檢測(cè)儀器的輔助下完成具有快速性、 敏感性且高通量性的閉蓋檢測(cè)，具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠、敏感性高的優(yōu)勢(shì)[14-15]。應(yīng)用 PCR 法進(jìn)行GBS檢測(cè)時(shí)，最短30分鐘即可獲得結(jié)果，檢出時(shí)間可控制在6小時(shí)內(nèi)，耗時(shí)明顯低于細(xì)菌培養(yǎng)法，因而更具臨床實(shí)踐意義[16-17]。本文通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，PCR方法診斷 GBS 的靈敏性為93.4%（156/167），特異性為99.3%（1673/1685），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.9%（156/168）和陰性預(yù)測(cè)值為99.3%（1673/1684），與國(guó)內(nèi)研究一致[16]，提示實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 對(duì)于 GBS 具有非常好的診斷效能，可及時(shí)、準(zhǔn)確的對(duì)GBS進(jìn)行診斷。因此，PCR 技術(shù)適用于孕婦GBS的篩查。孕婦GBS帶菌的相關(guān)危險(xiǎn)因素因國(guó)家地區(qū)不同而不同，因此需要進(jìn)行徹底的評(píng)估，選擇最適當(dāng)?shù)念A(yù)防策略[19]。我國(guó)尚缺乏GBS感染的臨床流行病學(xué)研究，進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查工作應(yīng)在不同地區(qū)進(jìn)行，從而明確實(shí)際孕婦GBS帶菌率、危險(xiǎn)因素及GBS與孕婦、新生兒的相關(guān)性，從而制定常規(guī) GBS 篩檢和有效預(yù)防治療措施，以防止?jié)撛诘哪笅氩涣冀Y(jié)局發(fā)生的可能性。