丹參酮ⅡA 對氧化型低密度脂蛋白誘導血管內皮損傷的防護作用*

唐 林，黎宗寶，白瑞娜

（1. 海南省人民醫(yī)院中醫(yī)科，海南 海口 570311； 2. 海南省人民醫(yī)院急救中心，海南 海口 570311；3. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院心血管內科，北京 100091）

血管內皮細胞結構及功能改變與心血管疾病的發(fā)生密切相關[1]。董霄等[2]研究發(fā)現，脂質中氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）代謝異常是誘導血管內皮細胞功能紊亂和平滑肌細胞增生的重要危險因素。體內OX-LDL過量時可導致膽固醇沉積于動脈血管壁，增加動脈硬化發(fā)生風險[3]。李婷等[4]研究發(fā)現，OX-LDL 可通過抑制Akt/mTOR/p70S6K 信號通路誘導人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）自噬。細胞自噬是在自噬相關基因調控下利用溶酶體降解受損細胞器及大分子物質的過程[5]。丹參酮ⅡA為丹參提取物，具有擴張血管、降血壓、抗血栓的功效，對大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導的氧化應激反應抑制作用顯著[6]。本研究中探討了丹參酮ⅡA對OXLDL 誘導的血管內皮損傷的保護作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC 細胞（上海紀寧生物科技有限公司，批號為JN-B1888）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號為11966025）；10% 胎牛血清（美國Gibco 公司，貨號為10099-141）；0.25%胰酶細胞消化液（上海碧云天生物技術有限公司，批號為C0201）；乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（北京百奧萊博科技有限公司，批號為YT412）；OX -LDL（美國Solarbio 公司，批號為H7950，規(guī)格為2 mg）；丹參酮ⅡA（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號為P0019）；硫代巴比妥酸（常州市海拓實驗儀器有限公司，批號為20170209）；rad680 型酶標儀（美國Bio 公司）；黃嘌呤氧化酶（大連美侖生物技術有限公司，批號為MB3079）；單丹磺酰戊二胺（MDC，上海懋康生物科技有限公司，批號為MX-4453）；山羊血清（美國Solarbio 公司，批號為SL038）；兔抗MAP1LC3[2]B 抗體（艾美捷科技有限公司，批號為R-155-100）；HRP 標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京碧云天生物科技有限公司，批號為A0216）；DAPI 染色液（北京雷根生物技術有限公司，批號為DA0001）。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)及處理：將HUVEC 接種于含DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件為37 ℃及5%CO2，每2 d 換液1 次，并進行傳代，直至細胞生長至對數期。取出細胞加入0.25%胰酶細胞消化液和EDTA溶液消化細胞。

丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力測定：將細胞分為空白對照組（A 組）、OX-LDL 處理組[25 mg/L（B1組）、50 mg/L（B2組）、75 mg/L（B3組）、100 mg/L（B4組）]、B4組+丹參酮ⅡA處理組[0 mg/L（C1組）、0.5 mg/L（C2組）、1.0 mg/L（C3組）、1.5 mg/L（C4組）]，分別處理24h 后測定細胞中MDA 和SOD 含量。

將50 μL 硫代巴比妥酸加入各組細胞中，充分混勻后95 ℃下水浴40 min，冷卻后離心10 min（轉速為1 000 r/min），取上清液在532 nm 波長處利用酶標儀測定吸光度，計算MDA 相對含量。將20 μL 黃嘌呤氧化酶加入各組細胞中，充分混勻后37 ℃下孵育20 min，測定其在450 nm 波長處的吸光度，計算SOD 活力。

細胞自噬：取A 組和各組細胞比較陽性細胞比例。細胞置離心儀離心5 min（轉速為1 000 r/min），加入磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，棄去上清液，再加入PBS 溶液重懸細胞，計數并調節(jié)細胞濃度至106個/mL；取適量細胞懸液置新EP 管中，加入50 μmol/L 單丹磺酰戊二胺，室溫避光染色30 min；PBS 清洗3 次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察其在355 nm 處的細胞計數。

自噬小體表達：取B4組細胞，分別用0，0.5，1.0，1.5 mg/L 丹參酮ⅡA處理，比較各組細胞陽性細胞比例，并觀察細胞自噬現象。每組細胞取3 份接種于24 孔板內，每孔細胞計數107，室溫孵育24 h；滴加封閉山羊血清，室溫封閉20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；以1 ∶200 的比例加入兔抗MAP1LC3[3]B 抗體，4 ℃下過夜，PBS 清洗3 次，每次5 min；以1 ∶500 的比例加入HRP 標記山羊抗小鼠IgG（H+L），室溫靜置1 h，PBS 溶液清洗3 次，每次5 min；加DAPI 染色液染色5 min，顯微鏡下觀察染色情況，PBS 清洗3 次，每次5 min；甘油封片后利用熒光倒置顯微鏡觀察自噬小體。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示，組內比較采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。危險因素采用Logistic 回歸分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MDA 含量及SOD 活力

與A 組比較，B 組MDA 含量明顯升高（F=493.724，P ＜0.05），SOD 活力明顯降低（F=9.770，P ＜0.05）；隨著OX-LDL 劑量增加，B 組MDA 含量逐漸升高（F=151.508，P ＜0.05），SOD 活力逐漸下降（F=6.035，P ＜0.05）；與B4組比較，隨著丹參酮ⅡA劑量增加，MDA 含量逐漸減少（F=374.014，P ＜0.05），SOD 活力逐漸增加（F=5.621，P ＜0.05）。詳見表1。

表1 各組MDA 含量及SOD 活力比較（±s，n=3）

表1 各組MDA 含量及SOD 活力比較（±s，n=3）

注：與A 組比較，*P ＜0.05；與B4 組比較，#P ＜0.05。

組別A 組B1 組B2 組B3 組B4 組MDA 含量（nmol/mL）1.68±0.12 4.57±0.15*5.74±0.18*6.52±0.21*7.87±0.23*SOD 活力（mU/mL）101.14±13.45 84.24±10.26*72.12±9.64*63.45±9.57*51.54±9.46*組別C1 組C2 組C3 組C4 組MDA 含量（nmol/mL）6.68±0.24#5.13±0.21#3.12±0.24#1.87±0.18#SOD 活力（mU/mL）68.97±12.87#76.57±13.54#86.45±13.73#97.42±13.57#

2.2 OX-LDL 對細胞自噬水平的影響

與A 組比較，隨著OX-LDL 劑量增加，細胞自噬水平逐漸上升（P ＜0.05）；不同OX-LDL 劑量陽性細胞比例分別為19.3%，27.1%，34.6%，45.3%，與A 組（5.2%）比較，陽性細胞比例明顯增加（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 丹參酮ⅡA 對OX-LDL 處理細胞自噬水平的影響

隨著丹參酮ⅡA劑量增加，細胞自噬水平逐漸下降（P ＜0.05）；不同丹參酮ⅡA劑量處理陽性細胞比例分別為43.5%，30.6%，23.6%，17.6%，與B4組（45.3%）比較，陽性細胞比例明顯降低（P ＜0.05）。詳見圖2。

2.4 細胞自噬現象

通過OX-LDL 處理后，細胞形成LC3 自噬小體，細胞自噬水平上升；丹參酮ⅡA干預后，細胞中LC3 自噬小體減少，細胞自噬水平下降。詳見圖3。

圖1 不同劑量OX-LDL 對細胞自噬水平的影響

圖2 不同劑量丹參酮ⅡA 對OX-LDL 處理細胞自噬水平的影響

圖3 各組細胞自噬現象

3 討論

動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病基礎與脂質代謝紊亂密切相關，其中OX-LDL 為導致血管內皮損傷的主要原因[7]。祖國醫(yī)學認為，AS 與氣虛、血瘀、痰濁有關[8]，故中醫(yī)治療常以活血化瘀為主[9]。丹參為常用中藥材，具有活血調經、祛瘀止痛的功效。丹參酮ⅡA為丹參提取物之一。陳少秀等[10]研究發(fā)現，丹參酮ⅡA可提高腎移植術后大鼠體內SOD 活性，抑制MDA 產生，抑制其腎小管上皮細胞凋亡，達到腎缺血再灌注損傷防護作用。

正常情況下，體內氧自由基反應與脂質過氧化反應的穩(wěn)態(tài)是維持體內新陳代謝的重要機制，動態(tài)平衡失調可引起新陳代謝失常及免疫功能下降，破壞生物膜及其功能，發(fā)生脂質過氧化。脂質過氧化可產生大量脂質過氧化產物MDA，改變細胞膜流動性及通透性，最終導致細胞結構改變。SOD 是體內的活性物質，能清除新陳代謝產生的有害物質。體內LDL 經氧化修飾后可形成OX-LDL，OX-LDL 通過引發(fā)自由基鏈式反應可產生多種反應性醛。本研究中通過OX-LDL 處理HUVEC細胞發(fā)現，隨著OX-LDL 劑量的增加，細胞MDA 含量逐漸升高，SOD 活力逐漸下降，表明OX-LDL 對血管內皮有損傷作用，并能使血管內皮細胞發(fā)生氧化應激反應。葉張章等[11]研究發(fā)現，原發(fā)性高血壓患者AS 的發(fā)生、發(fā)展與患者血清中膽紅素水平及氧化應激反應密切相關。郝陽等[12]研究發(fā)現，氧化應激可促進細胞自噬水平的升高，自噬水平上升可導致細胞程序性死亡而引發(fā)疾病。當細胞出現自噬現象時，附著于粗面內質網無核糖體的雙層膜包裹的胞質與細胞中降解的細胞器及蛋白質成分可形成自噬體[13]。自噬體是細胞程序性死亡中分解老化及損傷細胞的主體。本研究中通過OXLDL 處理HUVEC 細胞發(fā)現，隨著OX-LDL 劑量的增加，細胞自噬水平逐漸上升，陽性細胞比例逐漸增加，表明OX-LDL 可通過影響體內氧化應激反應，激活細胞自噬，產生自噬小體。本研究中選擇以100 mg/L OXLDL 處理過的細胞，通過不同質量濃度丹參酮ⅡA作用后發(fā)現，隨著丹參酮ⅡA劑量的增加，細胞中LC3 自噬小體減少，細胞自噬水平逐漸下降，陽性細胞比例逐漸降低，表明丹參酮ⅡA對細胞自噬水平有抑制作用，可減輕細胞氧化應激損傷，對細胞有保護作用。

綜上所述，體內OX-LDL 含量的增加對血管內皮具有損傷作用，丹參酮ⅡA可通過降低體內MDA 含量，增加SOD 活力，從而提高HUVEC 細胞抗氧化應激損傷能力，并降低細胞自噬水平，具有保護血管的作用。但本研究還缺乏對丹參酮ⅡA血管保護作用機制的研究，有待進一步深入探討。