廣西產桑葉調節血脂作用及成分鑒定研究*

曾 瑜，李遠杰，馬健雄，陳 路

（1. 廣西醫科大學第四附屬醫院·柳州市工人醫院，廣西 柳州 545005； 2. 廣西金海堂藥業有限責任公司，廣西 南寧 530313； 3. 廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023）

桑葉為桑科植物Morus albaL. 的干燥葉，桑葉及其制劑具有降血糖、降血壓、抗菌、抗病毒等多種藥理活性[1-4]，但調節血脂方面的研究較少，特別是關于血清藥物成分研究目前尚未見相關報道。廣西是我國桑葉主產地之一，藥材資源豐富，以桑葉為主藥制成的藥品制劑和藥食兩用的食品品類繁多，但質量參差不齊，其中藥材質量標準不夠完善是主要原因。本研究中對桑葉提取物調節血脂作用進行研究，對比了水提物、醇提物及水提物+醇提物混合給藥的調脂效果，明確了桑葉提取物入血成分，為完善桑葉藥材的質量標準及開發調脂類食品制劑提供參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（HPLC），G6530 型四級桿串聯飛行時間質譜（Q-TOF/MS）儀均購自美國安捷倫公司；Allegra 64R 型低溫高速離心機（美國Beckman 公司）；EL204 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；Milli Q 超純水儀（美國密理博公司）；試劑盒（上海榮盛生物技術有限公司）。

1.2 試藥

桑葉采摘于廣西南寧市郊，經廣西中醫藥大學藥用

植物教研室韋松基教授鑒定為正品；桑葉提取物（實驗室自制，為濃縮液冷凍干燥的粉末）；銀杏黃酮片（深圳海王藥業有限公司，批號為20161009）；槲皮素對照品、山柰酚對照品、山柰酚蕓香苷對照品、紫云英苷對照品、槲皮素蕓香苷對照品、木犀草素蕓香苷對照品、綠原酸對照品（批號分別為201607，201611，201606，201607，201602，201606，201607，純度均≥98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；Triton WR-1339（美國Sigma-Aldrich 公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher 試劑公司），其他試劑均為分析純。

1.3 動物

160 只SPF 級健康昆明種小鼠，體質量（20±2）g，雌雄各半，購于廣西中醫藥大學實驗動物中心（合格證號為桂醫動字第11005 號）。實驗動物給予普通飼料分籠飼養1 周以適應實驗條件。飼養環境溫度為22 ～27 ℃，相對濕度為50% ～70%。

2 方法與結果

2.1 調節血脂作用實驗

2.1.1 急性高脂血癥小鼠模型建立與給藥

將實驗小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、實驗組和陽性對照組，模型對照組、實驗組和陽性對照組分別尾靜脈注射Triton WR-1339（400 mg/kg）誘導血脂升高；正常對照組注射等體積生理鹽水。注射Triton WR-1339 后12 h，實驗組[水提物組、醇提物組、水提物組+醇提物組（1 ∶3）]分別用桑葉提取物（10，20，40 mg/kg 3 個劑量組）灌胃，陽性對照組以銀杏黃酮（20 mg/kg）灌胃。給藥后6，12 h，每組各隨機選取10 只小鼠，去眼球采血分離血清，于-38 ℃保存，備用。

2.1.2 血脂指標測定

按照試劑盒說明書進行操作，分別測定各組血清樣品中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量，并計算HDL-C/TC 及HDL-C/LDL-C。采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析。數據以表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05 為差異有顯著性。結果見表1。與正常對照組相比，其余各組小鼠注射Triton WR-1339 后，小鼠血清中TC，TG，LDL-C 均較注射前分別升高7.5，6，4 倍，HDL-C/TC 和HDL-C/LDL-C 分別降低41%和12%，可見小鼠造模成功。注射Triton WR-1339 后12 h，各組小鼠血清中TC，TG，LDL-C，LDL-C 水平比較，無顯著性差異（P＞0.05）。實驗組各組給藥后12 h，桑葉水提物、桑葉醇提物和桑葉水提物+桑葉醇提物均能降低由Triton WR-1339誘發的高脂血癥，且呈劑量依賴性，給藥劑量越大效果越好。可見，實驗組3 組中以混合給藥調脂效果最好，混合給藥高劑量組的效果顯著超過陽性對照組（P＜0.01）。

表1 給藥后12 h 桑葉提取物對急性高脂血癥小鼠血脂指標的影響（±s，n=10）

表1 給藥后12 h 桑葉提取物對急性高脂血癥小鼠血脂指標的影響（±s，n=10）

注：與正常對照組相比，*P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05；實驗組A/B/C 給藥劑量分別為10，20，40 mg/kg。

指標TC（mg/100 mL）TG（mg/100 mL）LDL-C（mg/100 mL）HDL-C/TC HDL-C/LDL-C正常對照組80.6±3.9 86.3±4.1 73.2±5.7 0.54±0.03 0.59±0.04模型組468.4±35.9*548.5±36.7*321.3±23.8*0.35±0.02*0.51±0.02陽性對照組318.6±36.2 452.8±38.4 230.7±18.3 0.39±0.03 0.55±0.02水提物組432.3±18.9/402.2±19.3/318.4±21.9#537.2±36.4/512.2±39.7/443.6±42.7#296.3±21.5/279.8±26.5/223.6±25.3#0.35±0.03/0.36±0.04/0.38±0.03 0.51±0.03/0.52±0.02/0.54±0.02實驗組（A/B/C）醇提物組374.6±42.1/323.9±31.4/285.4±22.3#528.2±49.4/501.5±49.1/421.7±26.8#258.7±28.6/224.5±21.2/201.2±10.1#0.36±0.03/0.37±0.04/0.39±0.03 0.52±0.02/0.53±0.03/0.55±0.02（水提物+醇提物）組371.1±37.4/289.6±38.2/217.3±29.8#508.2±24.7/451.4±31.7/398.3±35.4#257.9±19.5/203.8±13.2/163.6±21.7#0.37±0.04/0.39±0.05/0.43±0.03#0.53±0.03/0.55±0.04/0.57±0.05

2.2 血清藥物成分分析

2.2.1 溶液制備

取桑葉水提物+桑葉醇提物（1 ∶3）0.510 6 g，精密稱定，用50%甲醇溶解，超聲10 min，置離心機，速率13 000 r/min 離心10 min，取上清液作為供試品溶液。分別取2.1.1 項下實驗組（混合給藥組）的小鼠血清置離心機重新，速率13 000 r/min 離心10 min（25 ℃），取上清液作為血清樣品溶液。取山柰酚蕓香苷等對照品適量，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成相應質量濃度的混合對照品溶液，低溫保存，作為對照品溶液，備用。

2.2.2 成分分析

色譜柱為Agilent RRHD Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為90%乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脫[0 ～10 min 時A-B（20 ∶80），10 ～20 min時A-B（30 ∶70），20 ～30 min 時A-B（40 ∶60）]，流速為1.0 mL/min，檢測波長為365 nm。質譜采用AJS ESI源，掃描方式為正、負離子模式，采集范圍為m/ z100 ～1 700。

取上述溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，并結合文獻及質譜信息初步確定桑葉提取物降血脂入血成分。結果見表2 和圖1。在小鼠血清樣品中檢測出9 個入血成分，鑒定了7 個成分，其中3 個原形成分，4 個代謝產物。9 個入血成分主要為黃酮類化合物。

化合物1：在負離子模式下得到準分子離子m/ z353.0，碎片離子m/ z191.3[M-162]-可能是奎尼酸的特征峰，為準分子離子失去1 分子咖啡酸基團而得，推測為綠原酸的裂解途徑，通過與文獻[5]及綠原酸對照品比較，鑒定化合物1 為綠原酸。

化合物2：準分子離子m/ z611.0，準分子離子失去1 分子蕓香糖后的碎片為m/ z303.4，是黃酮類化合物典型的裂解途徑，通過與文獻[6]及槲皮素蕓香苷對照品比較，鑒定化合物2 為槲皮素蕓香苷。

表2 桑葉提取物入血成分譜峰信息歸屬

圖1 高效液相色譜圖

化合物3：準分子離子m/ z611.0，推斷為化合物2 的同分異構體，準分子離子失去1 分子蕓香糖后再失去1 個O·得到碎片離子m/ z287.4，通過與文獻[6]及木犀草素蕓香苷對照品比較，鑒定化合物3 為木犀草素蕓香苷。

化合物4：準分子離子m/ z595.0，其余碎片離子與化合物3 相似，推測化合物4 是由化合物3 失去1 個O·而得，通過與文獻[7]及山柰酚蕓香苷對照品比較，鑒定化合物4 為山柰酚蕓香苷。

化合物5：準分子離子m/ z449.0，有1 個m/ z287.4 的碎片離子，與化合物3 和4 相似，推測化合物5由化合物3 或化合物4 失去1 分子呋喃糖（m/ z162.0）而得，通過與文獻[8]及紫云英苷對照品比較，鑒定化合物5 為紫云英苷。

化合物7 和化合物9：兩者的準分子離子峰在化合物2 和4 的碎片離子中均有出現，推測為化合物2 和4的母核，通過與文獻[5]及槲皮素、山柰酚對照品比較，鑒定化合物7 為槲皮素，化合物9 為山柰酚。

3 討論

血清藥物化學于1989 年由日本學者田代真一提出，是血清中藥效物質較科學、有效的研究方法，也是中藥藥效物質基礎研究的重要手段。近年來，該研究方法在國內迅速發展，許多專家、學者做了大量的研究，為闡明中藥物質基礎及作用機制作出了貢獻[9-10]。高脂血癥是導致動脈粥樣硬化和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）等心腦血管疾病的危險因素之一，是中老年人的常見病、多發病[11]。現代研究發現，桑葉提取物能顯著拮抗急性高脂血癥小鼠中的TC，TG，HDL-C 升高，對動脈粥樣硬化和冠心病等疾病有一定的預防作用[12-14]。血清藥物分析能精準確定發揮藥效的具體物質成分，在中藥研究方面也初見成效，對藥材質量標準的完善和深度開發有重要作用[15-16]。

本研究中仍有幾個值得注意的問題。一是在進行調節血脂實驗時，混合給藥組的水提物與醇提物的混合比例。在前期實驗中曾嘗試了水提物+醇提物（1 ∶1，1 ∶2，1 ∶3，2 ∶1，3 ∶1）多種混合比例，發現混合比例不同調脂效果不一樣，其中以水提物+醇提物（1 ∶3）效果最好。二是血清的取樣和采集時間。有學者在研究血藥成分時直接用健康小鼠給藥后采集血清，因涉及健康體和帶病體對藥物攝取是否一致，科學性還需要進行更深入的研究探討。為保證實驗條件的一致性和更具有針對性，本研究中采用的是給藥后6 h 的小鼠血清，此時血藥濃度最高，對血藥成分分析較有利。三是在成分鑒定方面，血清中同時檢測出黃酮苷和苷元。但從圖譜信息來看，苷元的含量極少，可能是尚未代謝完成的遺留成分。另有2 個化合物尚未鑒定出來，但根據生源途徑及離子碎片分析，初步推測為黃酮類或綠原酸衍生物，將在下一步工作結合更多的色譜技術對其進行解析。