家兔體內(nèi)泊那替尼固體脂質(zhì)納米粒藥代動力學(xué)研究

熊遠(yuǎn)果，高潔芳，沈 瑤，張 洪

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060）

泊那替尼（ponatinib）是繼第1 代酪氨酸酶抑制劑（TKI）伊馬替尼和第2 代達(dá)沙替尼之后的新一代替尼類藥物，主要用于成人耐藥性慢性粒細(xì)胞白血病和費(fèi)城染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血病的治療，包括難抑制的T315I 突變[1]，且對加速期耐藥性白血病也有一定的臨床效果。藥理學(xué)試驗(yàn)證明，泊那替尼通過與三磷酸腺苷（ATP）競爭BCL-ABL 融合蛋白中結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制融合蛋白的表達(dá)[2]。但目前泊那替尼上市制劑為僅為口服速釋片，其不良反應(yīng)率高，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用范圍[3-4]。固體脂質(zhì)納米粒（SLN）是近年來興起的以類脂材料為核心的納米粒給藥體系[5]。其脂質(zhì)材料具有良好的生物相容性和靶向性，緩控釋效果顯著，可降低藥物的毒副作用[6-7]，且具有較好的穩(wěn)定性，可用于多種不同的給藥途徑，并可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣泛[8-10]。為促進(jìn)泊那替尼更安全、有效地用于臨床，本研究中擬將前期制備的泊那替尼固體脂質(zhì)納米粒（P-SLN）混懸液進(jìn)行家兔體內(nèi)藥代動力學(xué)試驗(yàn)，探討新劑型在體內(nèi)的緩控釋效果及生物利用度，為開發(fā)泊那替尼新劑型提供研究基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

島津L20 型高效液相色譜儀（UV 檢測器，日本島津公司）；TG328A 型電子分析天平（上海天平儀器廠）；Vortex-2 型渦旋儀（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司）；3K30 型冷凍高速離心機(jī)（德國Sigma 公司）。

1.2 試藥

泊那替尼（武漢星耀艾克生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號為06771，含量99.0%）；泊那替尼對照品（上海翰香生化制品有限公司，批號為20121226，含量99.3%）；泊那替尼固體脂質(zhì)納米粒（自制）；肝素鈉注射液（天津市生物化工制藥廠）；甲醇、乙腈均為高效液相色譜（HPLC）純（美國天地公司）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

新西蘭兔12 只，體質(zhì)量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，購自武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，動物實(shí)驗(yàn)合格證號為SCXK ＜Hubei ＞2014-0201。動物實(shí)驗(yàn)符合動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會《實(shí)驗(yàn)動物福利倫理原則》要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 P-SLN 制備

取泊那替尼10 mg、單硬脂酸甘油酯50 mg、蛋黃卵磷脂100 mg，精密稱定，于（75±2）℃水浴溶于5 mL 的無水乙醇形成有機(jī)相。另取150 mg 泊洛沙姆188，溶于10 mL 蒸餾水中，構(gòu)成水相。將有機(jī)相加入水相中，于10 000 r/min 高速乳化10 min，并于等溫1 000 r/min繼續(xù)攪拌15 min，除去有機(jī)相。隨后快速分散于比例為1 ∶5 的0 ～2 ℃水分散相中，于10 000 r/min 高速均質(zhì)10 min，即得P-SLN 混懸液。制備的P-SLN 平均粒徑為（155.1±4.32）nm，PDI 為（0.152±0.009 0），Zeta 電位為（ -22.0±1.71）mV，包封率為（67.73±1.84）%（n=3）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

據(jù)預(yù)試驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[11]，確定檢測條件。色譜柱：Agilent Zorbax Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%三乙胺乙酸緩沖鹽（78 ∶22，pH=7）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

取泊那替尼對照品10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加入適量無水乙醇上下振蕩溶解，定容至刻度，即為100 μg/mL 的對照品貯備液，分別取適量，置10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量溶度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 系列質(zhì)量濃度梯度的對照品溶液。取一定量的泊那替尼對照品，精密稱定，加入適量0.5%羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，渦旋混勻，即得對照組泊那替尼對照液，作為對照組動物灌胃液。精密量取一定量P-SLN，直接加入生理鹽水配制成均勻溶液，即制劑組P-SLN 溶液，作為給藥組動物灌胃液。

2.2.3 血清樣品處理

取新西蘭兔全血，置經(jīng)肝素鈉處理后的離心管中，于低溫4 ℃下，10 000 r/min 冷凍離心10 min，取離心后的上清液，作為空白血清樣品。精密量取200 μL 血清樣品，加入200 μL 冷甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩混合5 min，于10 000 r/min 離心15 min，取上清液20 μL 過0.45 μm尼龍膜濾過后進(jìn)樣。

2.2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取新西蘭兔空白血樣、空白血樣，加適量泊那替尼對照品溶液和給藥后血樣樣品，按照2.2.3項(xiàng)下方法處理后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，得色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明，在此條件下，空白血樣對樣品含量測定無干擾，該方法專屬性好。

線性關(guān)系考察：精密量取適量質(zhì)量濃度的對照品溶液，置試管中，氮?dú)獯蹈桑】瞻籽獦?00 μL，渦旋混勻，制成血藥濃度為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的樣品，按2.2.3 項(xiàng)下方法處理后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。以測定血樣峰面積平均值（A）對血樣濃度（C，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=20 067C-1 347，r=0.999 4 （n=5）。結(jié)果表明，泊那替尼血樣質(zhì)量濃度在0.2 ～10.0 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取適量泊那替尼對照品溶液，氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻籽獫{，分別精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 種不同質(zhì)量濃度的血樣溶液，按2.2.3 項(xiàng)下方法處理后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，于1 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5 次，不同天內(nèi)，每天進(jìn)樣1 次，連續(xù)5 d，記錄色譜圖進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果日內(nèi)精密度的RSD分別為1.14%，0.90%，1.83% （n=5），日間精密度的RSD為0.25%，1.25%，1.37%（n=5）。

提取回收率試驗(yàn)：取適量泊那替尼對照品溶液，氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻籽獫{，分別精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 種不同質(zhì)量濃度的血樣溶液，按2.2.3 項(xiàng)下方法處理后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。同時(shí)，取相同質(zhì)量濃度未經(jīng)過處理的對照品溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算提取回收率，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果平均加收率分別為85.69%，87.95% ，86.45%，RSD為3.40%，6.32%，5.92%，表明該方法提取回收率滿足生物樣品測定要求。

方法回收率試驗(yàn)：取適量泊那替尼對照品溶液，氮?dú)獯蹈桑尤肟瞻籽獫{，分別精密配制高、中、低（5.0，1.0，0.2 μg/mL）3 種不同質(zhì)量濃度的血樣溶液，按2.2.3 項(xiàng)下方法處理后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對應(yīng)質(zhì)量濃度，與加入的已知質(zhì)量濃度相比，計(jì)算方法回收率，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果平均加收率分別為97.02%，103.13%，105.33%，RSD為2.17%，5.50%，3.52%，表明方法回收率滿足生物樣品測定要求。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 藥代動力學(xué)試驗(yàn)

將12 只健康新西蘭兔，雌雄各半，隨機(jī)分為2 組，每組6 只。給藥前，動物均禁食12 h，按15 mg/kg 劑量分別給對照組和給藥組動物灌胃給藥泊那替尼對照品溶液和P-SLN 溶液。給藥后，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h 耳緣靜脈取血2.0 mL。所取的全血樣品置肝素化的離心管中，于低溫4 ℃下10 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。

將上述采集的血樣，按照2.2.3 項(xiàng)下方法處理后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)（）、血藥濃度為縱坐標(biāo)（Y），作P-SLN 的藥-時(shí)曲線，詳見圖2。對所測得的血藥濃度數(shù)據(jù)，采用DAS 2.0 藥代動力學(xué)軟件進(jìn)行擬合，得對照組和制劑組的藥代動力學(xué)參數(shù)，詳見表1。采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得參數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。由圖2 和表1 可見，與對照組比較，P-SLN 溶液在口服后，其藥時(shí)曲線下面積（AUC）是對照組的3.39 倍，AUMC 為14.87 倍，平均滯留時(shí)間（MRT）是4.55 倍，半衰期（t1/2）為4.44 倍，清除率（CL）為0.29 倍（P＜0.001）。結(jié)果顯示，將泊那替尼制成固體脂質(zhì)納米粒后，其生物利用度顯著提高，體內(nèi)滯留時(shí)間增加，清除率降低，半衰期延長，緩釋效果顯著，達(dá)到了試驗(yàn)預(yù)期目標(biāo)。

圖2 P-SLN 藥-時(shí)曲線圖（n=6）

表1 P-SLN 口服給藥后藥代動力學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

表1 P-SLN 口服給藥后藥代動力學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

注：與對照組相比，*P ＜0.001，#P ＜0.01。

項(xiàng)目AUC[（μg/mL）·h]AUMC（μg/mL）MRT（h）t1 /2（h）CL [（mg/kg）/h/（μg/mL）]V（L/kg）對照組3.53±0.21 9.38±2.26 2.63±0.59 1.82±0.41 4.26±0.24 11.12±1.92給藥組11.98±0.74*139.44±6.75*11.65±0.27*8.08±0.19*1.26±0.080*14.66±1.26#

3 討論

泊那替尼作為一種全新的小分子藥物，上市時(shí)間較短，目前對其在體內(nèi)血藥濃度檢測的方法學(xué)報(bào)道較少。本研究中在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了檢測條件，結(jié)果顯示，優(yōu)化后的HPLC 法準(zhǔn)確性、專屬性和重復(fù)性均表現(xiàn)良好。相較于LC-MS 法[12]及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[13]，該方法避免了對精密儀器的依賴和昂貴專用試劑的使用，操作簡單，成本較低，適用于大規(guī)模臨床血樣濃度的測定。

本研究中，血藥濃度檢測受到血樣蛋白的干擾較大。根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]，主藥泊那替尼與血清蛋白結(jié)合率為99%，故前期對蛋白的處理尤其重要。試驗(yàn)選用了不同比例的甲醇、乙腈、氯仿等多種溶劑沉淀血清蛋白，結(jié)果顯示，等體積的甲醇除蛋白效果良好。一方面避免了樣品過度稀釋，降低了檢測限；另一方面避免了高危溶劑的使用，保護(hù)了試驗(yàn)者的安全。同時(shí)，還研究了萃取法對試驗(yàn)影響，結(jié)果顯示，液-液萃取降低了血藥中的主藥含量，且相關(guān)蛋白未能除盡，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確，故最終確定采用等體積甲醇處理樣品。

藥代動力學(xué)試驗(yàn)中，給藥組藥-時(shí)曲線顯示有2 個(gè)吸收峰。第1 個(gè)峰為吸附在納米粒表面的泊那替尼釋藥吸收，第2 個(gè)峰為包封于固體脂質(zhì)納米粒核心的主藥的釋放[15]。2 個(gè)吸收峰之間的峰谷，可能與淋巴細(xì)胞的清除有關(guān)[16]。在釋藥的后期，給藥組消除速率慢于對照組，表明在內(nèi)環(huán)境中，納米粒釋藥速率減慢，藥物的清除率降低，滯留時(shí)間延長，緩釋效果明顯[17-18]。結(jié)果顯示，將泊那替尼制成固體脂質(zhì)納米可提高其在家兔體內(nèi)的生物利用度。

在動物實(shí)驗(yàn)過程中，對照組動物表現(xiàn)為活動范圍縮小、活動頻率降低、欲望減弱，并伴有腹瀉現(xiàn)象。給藥組未出現(xiàn)相關(guān)現(xiàn)象，且在活動范圍頻率上表現(xiàn)為前后無明顯差異，同時(shí)未觀測到有胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生，表明將泊那替尼包封于脂質(zhì)納米粒內(nèi)可降低其在體內(nèi)的不良反應(yīng)。另外，本研究結(jié)果顯示，脂質(zhì)納米粒的生物利用度顯著高于對照組，可在保證相同的生物利用度上，降低單次給藥劑量，且可進(jìn)一步降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。