正交試驗法優選口瘡穴位貼提取工藝

周秋娟，瞿發林，董文△

（1. 江蘇省常州市武進區中西結合醫院，江蘇 常州 213003； 2. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇四醫院，江蘇 常州 213003）

口瘡穴位貼處方為聯勤保障部隊第九〇四醫院中醫科驗方“口疳散”，由生大黃、吳茱萸、細辛、肉桂、川黃連5 味中藥組方，將5 味中藥研粉以醋調勻，搓制成直徑約為1 cm 的藥球，敷貼于雙足底涌泉穴處，固定，夜敷晝去。方中生大黃、黃連味苦性寒，清熱瀉火，用于上焦中焦實火上炎；吳茱萸、細辛、肉桂為溫里藥，用于浮越之火引火歸原，導熱下行[1-2]。方中吳茱萸、細辛、肉桂、川黃連4 味中藥的主要成分有揮發油類、生物堿類、黃酮類等，其中揮發油類和生物堿類是其發揮藥理作用的主要物質基礎[3-7]。為了提升中藥有效成分的利用率，最大限度發揮中藥驗方的功效，將口瘡穴位貼處方中吳茱萸、細辛、肉桂、川黃連4 味中藥，用乙醇提取濃縮成稠膏后，再加入生大黃細粉及適量醋調制成貼劑。本研究中采用正交試驗，以吳茱萸堿含量及浸膏量為綜合評價指標，優選提取工藝，為口瘡穴位貼的研制和生產提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 系列高效液相色譜儀，Waters CapLC2487 型雙λ 吸光度檢測器，Empower2 數據處理系統（美國Waters 公司）；FA1004 型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司·天平儀器廠，精度為萬分之一）；AE240S型電子分析天平（梅特勒-拖利多儀器有限公司，精度為十萬分之一）；R201 型旋轉蒸發儀，SHB-3 型循環水式多用真空泵（上海申勝生物技術有限公司）；HHS 型恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠）；YB-ⅠA 型真空恒溫干燥箱（天津市金洲科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

吳茱萸（浙江產，批號為181118），細辛（遼寧產，批號為181118），肉桂（廣東產，批號為180807），川黃連（四川產，批號為181221），均購自江蘇華洪藥業科技有限公司，經聯勤保障部隊第九〇四醫院瞿發林主任藥師鑒定為蕓香科植物吳萊英Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth. 的干燥近成熟果實，馬覺鈴科植物北細辛Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var. 的干燥根和根莖，樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl. 的干燥樹皮，毛莫科植物黃連Coptis chinensisFranch. 的干燥根莖；吳茱萸堿（南京世洲生物科技有限公司，批號為201901WZYJ，規格為20 mg，含量按98%計）；甲醇及乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 吳茱萸堿含量測定[8]

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Lichrosphe C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（50 ∶50）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：225 nm；進樣量：20 μL。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

稱取60 ℃干燥至恒重的吳茱萸堿對照品9.7 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液，搖勻，備用。精密量取每個煎煮水平的藥材提取液適量（2%），減壓濃縮至干，殘渣加甲醇超聲溶解3 次，每次8 mL，并定溶至25 mL 容量瓶中，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。取細辛、肉桂、川黃連3 味藥材同法回流提取，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.1.2 項下3 種溶液適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。

線性關系考察：精密吸取對照品貯備液，分別制成質量 濃度為97.00，48.50，24.25，19.40，12.12，9.7 μg/mL 的系列溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，以最小二乘法進行直線回歸，得回歸方程Y=35 532X+14 074，r=0.999 9（n=6）。結果表明，吳茱萸堿進樣量在1.94 ～0.194 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為48.50 μg/mL的對照品溶液，按擬訂色譜條件重復進樣6 次，記錄峰面積。結果吳茱萸堿峰面積的RSD為0.87%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.1.2 項下同一份供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果吳茱萸堿峰面積的RSD為1.78%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果吳茱萸堿峰面積的RSD為1.76%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的口瘡穴位貼提取液5.0 mL，分別按高、中、低質量濃度加入對照品貯備液（吳茱堿97.00 μg/mL）2.0，5.0，10.0 mL，平行制備6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

2.2 浸膏得率測定[9]

蒸發皿預處理：蒸發皿105 ℃烘5 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱定質量（W1），繼續烘1 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱定質量（W2），當│W1-W2│≤0.3 mg 時，置干燥器中存放，備用。

浸膏量測定[8]：剩余提取液于電熱恒溫水浴鍋80 ℃減壓濃縮至稠膏狀，轉移至蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃烘5 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱定質量（W3），繼續烘1 h，取出，置干燥器中冷卻至室溫，稱定質量（W4），直到│W3-W4│≤0.3 mg。浸膏 量=（W4-W2）/98%，浸膏得率=（浸膏量/藥材量）×100%。

2.3 評分標準制訂

以口瘡穴位貼提取物浸膏量和吳茱萸堿含量作為評價指標，以加權評分法計算綜合評分，根據2 個指標的重要程度，將口瘡穴位貼提取物浸膏量和吳茱萸堿含量的權重系數分別定為0.3 和0.7，二者綜合評分計算公式為：總分= [（浸膏質量/浸膏質量max×0.3）+（吳茱萸堿含量/吳茱萸堿含量max×0.7）]。

2.4 正交試驗優選

因素與水平：以乙醇濃度（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數（因素D）為參考因素，以口瘡穴位貼提取物浸膏量和吳茱萸堿含量作為評價指標，設4 個因素3 個水平。詳見表2。

表2 正交試驗因素水平表

正交試驗設計：按處方配比分別稱取吳茱萸、細辛、肉桂、川黃連4 味中藥材置三頸圓底燒瓶中，按煎煮因素水平回流提取（煎煮前先將藥材浸泡1 h），提取液用8 層紗布壓榨濾過，合并提取液，攪勻，得口瘡穴位貼的藥材提取液。依法行L9（34）正交試驗，測定浸膏量和吳茱萸含量。結果見表3。

表3 L9（34）正交試驗結果（n=9）

注：*指總藥材35.5 g（吳茱萸25 g，細辛5 g，肉桂2.5 g，川黃連3 g）。

結果分析：由表3 可見，各因素影響程度為A ＞D ＞C ＞B。由表4 可見，因素A（F=392.315 3，P＜0.01）對提取工藝影響極顯著，因素D（F=94.656 4，P＜0.05）對提取工藝影響顯著。可見，最佳提取工藝應為A1B3C2D3，即12 倍量70%乙醇，回流提取3 次，每次1.5 h。

表4 方差分析結果

注：F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00。

2.5 最佳工藝驗證

按優選的最佳提取工藝制備5 批樣品，測定浸膏量和吳茱萸堿含量，進行綜合評分。結果口瘡穴位貼浸膏平均量為11.18 g（RSD=1.51%，n=5），吳茱萸堿含量為65.93 mg（RSD=1.07%，n=5）。詳見表5。

表5 最佳提取工藝驗證試驗結果（n=6）

3 討論

穴位敷貼療法是以中藥經絡學為理論依據，通過刺激穴位，發揮藥物及穴位的雙重功效達到治病、防病的目的一種療法。涌泉穴是腎經井穴，古代采用藥物敷貼涌泉穴治療腳氣、厥證、狂證、口咽病、耳病、鼻病、目疾及難產等多種常見癥，現代采用藥物敷貼涌泉穴治療腹瀉、便秘、嘔吐、哮喘、失眠、高血壓、疼痛、口瘡等病證[10-13]。

中藥穴位貼組方多是古方或中醫驗方，是將中藥碾成細末后，以水、醋、酒等為基質，制成散劑、糊劑和膏劑等劑型，直接貼于穴位患處，為無創傷性外治療法的藥物制劑。中藥穴位貼多為散劑、糊劑和膏劑的傳統劑型，皮膚外敷給藥起效較慢，且人體所吸收的藥量有限。為了提升中藥穴位貼有效成分的利用率，最大發藥物功效，滿足現代人使用方便的需求，將口瘡穴位貼處方中含有主要成分為揮發油類、生物堿類、黃酮類等發揮主要藥理作用的吳茱萸、細辛、肉桂、川黃連4 味中藥進行制劑工藝優選。

本研究中采用高效液相色譜法，以提取物浸膏量和吳茱萸堿含量為綜合評價指標，通過正交試驗法優選出了口瘡穴位貼的最佳提取工藝。經驗證試驗，該提取工藝簡單、可行、穩定，可為制劑的開發與使用提供參考。