參鹿補片質量標準研究

黃武軍，付向紅，鄒國輝

（仁和＜集團＞發展有限公司，江西 樟樹 331200）

參鹿補片組方為紅參、鹿肉、淫羊藿、狗脊、墨旱蓮、玉竹等14 味中藥材，原標準中已有齊墩果酸的薄層色譜（TLC）鑒別法[1]。采用乙醚作為提取溶劑，乙醚的穿透力低，不能充分提取出齊墩果酸，供試品色譜中齊墩果酸斑點淡，拖尾嚴重，且比對照品色譜中相應斑點偏高，此情況易出現對結果判定產生分歧，故對供試品的處理方法、展開劑及顯色方法進行了修訂。為了更有效地控制該品的質量，本研究中對參鹿補片進行了定性定量研究，不僅對齊墩果酸的TLC 鑒別方法進行了修訂，還采用TLC 法對人參皂苷Rg1進行定性鑒別，高效液相色譜（HPLC）法測定淫羊藿苷含量，旨在為該制劑的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Agilent 1200 型（美國安捷倫公司）；島津LC-20AD 型（日本島津公司）。色譜柱：Diamonsil（鉆石1 代）C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Diamonsil（2）C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Spurisil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。CP224S 型電子天平（d=0.1 mg），CP225D 型電子天平（d=0.01 mg，0.1 mg），均購自賽多利斯公司。

1.2 試藥

齊墩果酸對照品（批號為110709-200505），人參皂苷Rg1對照品（批號為110703-201027，含量以97.7% 計），淫羊藿苷對照品（批號為110737-200415），均購自中國食品藥品檢定研究院；參鹿補片（批號分別為150301，150302，150303），不含紅參、女貞子、淫羊藿的陰性樣品，均由江西藥都仁和制藥有限公司提供；硅膠G 薄層板（批號為20161014，青島海洋化工廠）；乙腈、甲醇均為色譜純（購自美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

齊墩果酸[2]45-46，429-430，496-497，526，949-950，1258，1366[3-4]：取樣品10 片，研細，加2%的氫氧化鈉溶液30 mL，超聲處理30 min，離心（3 000 r/min，5 min），上清液用鹽酸調pH 為2 ～3，用乙醚振搖提取2 次，每次30mL，合并乙醚提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另按處方取除女貞子的其他藥材制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502]，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以環己烷-丙酮-乙酸乙酯（5 ∶2 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與齊墩果酸對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

人參皂苷Rg1[2]440-442，446-447，864-865，868，1124-1126，1276-1278[5]：取樣品10 片，研細，加甲醇40 mL，水浴回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL 使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的水50 mL 洗滌，棄去水洗液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另按處方取除紅參的其他藥材制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。再取人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1 mL 中含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2015 年版《中國藥典（一部）》通則0502]，吸取上述3 種溶液各5 ～10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與人參皂苷Rg1對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 淫羊藿苷含量測定[2]327-328，1095-1096，1098，1369-1370[6-8]

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-水（29 ∶71）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。在此條件下的色譜圖見圖2。理論板數按淫羊藿苷峰計算應不低于2 000，且分離度大于1.5。

2.2.2 溶液制備

取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成每1 mL 中含10 μg 的溶液，作為對照品溶液。取本品20 片，精密稱定，研細，取約2 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加入稀乙醇40 mL，超聲處理（功率350 W，頻率35 kHz）1 h，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。另按處方取不含淫羊藿的其他藥材制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2.2 項下3 種溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果淫羊藿苷峰能較好地分離，保留時間適中，陰性無干擾，專屬性好。詳見圖2。

線性關系考察：取淫羊藿苷對照品10.46 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加稀乙醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得母液（104.6 μg/mL），再分別精密吸取1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，分別置50 mL 容量瓶中，用加稀乙醇稀釋成不同質量濃度的對照品溶液。按擬訂色譜條件進樣10 μL，記錄峰面積。以淫羊藿苷的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=46.214X-1.720，r2=1.000（n=6）。結果表明，淫羊藿苷質量濃度在2.092 ～18.828 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液（質量濃度為10.46 μg/mL），連續進樣6 次，記錄峰面積。結果的RSD為0.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品（批號為150301）溶液，分別于放置0，2，4，6，8，10，12，24 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.7%（n=8），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

圖2 高效液相色譜圖

重復性試驗：取供試品（批號為150301）6 份，按含量測定項下方法試驗，測定淫羊藿苷的含量。結果6 份樣品中淫羊藿苷平均含量為240.04 μg/g，RSD為1.3%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取本品（已知淫羊藿苷含量為240.04 μg/g）1 g 共6 份，精密稱定，分別定量加入淫羊藿苷對照品溶液，測定淫羊藿苷的含量，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

耐用性試驗：在不同時間、不同人員分別采用不同的高效液相色譜儀及不同的色譜柱，改變色譜條件，如溫度（35±5）℃、流速（1.0±0.2）mL/min、流動相比例±5%情況下，對同一批樣品進行測定。結果淫羊藿苷峰均能達到基線分離，RSD為1.7%（n=5），表明方法耐用性良好。

3 討論

3.1 TLC 鑒別試驗條件選擇

齊墩果酸為三萜類皂苷元。本試驗中，采用甲醇、氯仿、乙醚超聲或回流提取，斑點不清晰；采用氫氧化鈉溶液超聲提取，可水解生成皂苷元（采用酸水解會發生脫水、環合、雙鍵轉移等），再用鹽酸溶液調至酸性，用有機溶液劑萃取，結果斑點清晰、圓整、分離好。比較了不同展開劑的分離效果，如環己烷-丙酮-乙酸乙酯（5 ∶2 ∶1）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（40 ∶1 ∶1）、甲苯-乙酸乙酯-醋酸（5 ∶1 ∶1）上層溶液等，以環己烷-丙酮-乙酸乙酯（5 ∶2 ∶1）的分離效果為佳。

參鹿補片中紅參為藥材原粉入藥，其中的人參皂苷Rg1易溶于醇，故用甲醇回流提取，更易穿透細胞壁，提取充分；但參鹿補片含有大量的水溶性成分，故甲醇提取液蒸干后，殘渣加水使溶解，用正丁醇提取，再用水洗滌正丁醇提取液，進一步排除了雜質的干擾。比較了不同展開劑的分離效果，如三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 ∶40 ∶22 ∶10）10 ℃以下放置的下層溶液，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下層溶液的分離效果為佳。

3.2 含量測定指標及HPLC 條件選擇

參鹿補片處方由14 味中藥材組成，紅參為君藥，主含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，原藥材已有含量控制。同為君藥的鹿肉，主要含有蛋白質、脂肪、無機鹽、糖和一定量的維生素，選擇此類成分作為含測指標無針對性。故選擇臣藥淫羊藿中淫羊藿苷作為含量測定指標。本試驗中比較了不同體系和比例的流動相，如甲醇-水（60 ∶40）、乙腈-水（30 ∶70）等，結果采用乙腈-水（29 ∶71）時淫羊藿苷峰形對稱、基線平穩，分離效果良好；比較了不同提取溶劑，如甲醇、乙醇、50%甲醇溶液、稀乙醇制備供試品溶液，結果采用甲醇、乙醇時峰對稱性差，兼顧環保考慮，選擇稀乙醇作為提取溶劑；比較了超聲處理及加熱回流的處理方式，含量結果無明顯差異，故選擇簡單、快捷、常溫的超聲處理方法。

由于不同產地、不同批次的淫羊藿中淫羊藿苷含量高低不同[9-15]，根據多批次樣品檢測結果統計，參鹿補片中淫羊藿苷的含量定為應不低于每片60 μg 為佳。