高效液相色譜法測定胃痛寧片中天仙子浸膏含量

馬 麗，楊甲忠△，孟 珊，張 征，楊 爽

（1. 河北省承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，河北 承德 067101； 2. 河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011）

天仙子為茄科Solanaccav植物莨菪HyoscyamusnigerL. 的干燥成熟種子，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味苦、辛，有毒，具有定痛、止痛功效，常用于治療癲狂、風(fēng)痹厥痛、惡瘡等癥[1]。從天仙子中分離出的托烷類生物堿（主要為莨菪堿和東莨菪堿）被認(rèn)為是天仙子發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的有效成分[2-3]，但天仙子有毒，屬于慎用藥，天仙子浸膏在該處方中每1 000 片投料量較低（25 g），又因其投料量少和主成分難分離提取等原因，對天仙子主成分的含量測定一直是難點(diǎn)。本研究中參考文獻(xiàn)[4-7]，采用75%乙醇多次超聲提取、濃氨溶液轉(zhuǎn)移、三氯甲烷超聲提取后，采用高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫法成功建立了胃痛寧片中天仙子浸膏中主成分氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的含量測定方法[8-12]，旨在為胃痛寧片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters e2695 型高效液相色譜儀（Waters 2489 檢測器，Empower 色譜工作站，進(jìn)樣精度≤0.5%RSD，波長準(zhǔn)確度±1 nm，美國沃特斯公司）；Moli-Q Intergral水純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；XS105DU 電子天平（梅特勒-托利多公司，感量0.01 mg）；C9860A 型超聲波清洗儀（天津科貝爾光電技術(shù)有限公司，功率500 W，40 kHz）。氫溴酸東莨菪堿對照品（批號為100049-201009，供含量測定用，含量91.7%），硫酸阿托品對照品（批號為100040-201011，供含量測定用，含量96.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；胃痛寧（市售，購于3 個不同廠家，共14 批）。乙腈、甲醇均為色譜純（德國默克MERCK）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B，含0.02%的三乙胺），梯度洗脫（0 ～35 min 時(shí)流動相A 6%，35 ～40 min時(shí)流動相A 6% ～30%，40 ～50 min 時(shí)流動相A 30% ～6%，50 ～55 min 時(shí)流動相A 6%）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃。在此條件下的色譜圖見圖1。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品與相鄰雜質(zhì)峰的分離度分離度均大于1.5（東莨菪堿質(zhì)量=氫溴酸東莨菪堿質(zhì)量×0.7894；莨菪堿質(zhì)量=硫酸阿托品質(zhì)量×0.855 1）。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取氫溴酸東莨菪堿對照品11.70 mg、硫酸阿托品對照品10.73 mg，精密稱定，置同一100 mL 容量瓶中，加50%甲醇70 mL，超聲使溶解，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。取對照品貯備液5 mL，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液（每1 mL 中各含0.02 mg 的混合溶液）。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：取本品20 片，除去包衣，研細(xì)，取細(xì)粉（5 片量），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加75%乙醇40 mL，超聲提取3 次（功率250 W，40 kHz），每次30 min（冰盒降溫），離心，合并上清液，蒸干，殘?jiān)脻獍比芤海?→100）20 mL 轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷超聲提取1 min，提取5 次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇5 mL 分次超聲轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，放至室溫，加50%甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方制備不含天仙子浸膏的陰性樣品，按供試品溶液方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別取上述3 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果表明，在該色譜條件下，供試品溶液色譜中各被測組分峰分離良好，且陰性對照品溶液對各被測組分無干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，mg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為Y氫=4 957 316.3X+1 583.7（r=0.999 9），Y硫=8 371 107.0X-1 137.0（r=0.999 9）。結(jié)果表明，氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品質(zhì)量濃度分別在0.002 146 ～0.107 29 mg/mL 和0.002 071 ～0.103 54 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：吸取混合對照品1 mL，置10 mL 容量瓶中，連續(xù)進(jìn)樣10 次。結(jié)果氫溴酸東莨菪堿的RSD為1.0%，硫酸阿托品的RSD為0.8%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份供試品溶液（批號為141004），室溫放置0，4，8，16，24 h 后依法測定，結(jié)果見表1。可見，供試品溶液中2 種成分24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為141004）6 份，精密稱定，平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果見表2，可見方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批供試品（批號為141004）9 份，精密稱定，平均分為3 組，分別加入混合對照品溶液1.0，1.5，2.0 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測定

取14 批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 提取方法選擇

取樣量確定：因天仙子浸膏在該處方中投料量較低，試驗(yàn)過程中分別取1 片、約1 g、約2 g、5 片分別進(jìn)行比較，5 片量提取出的目標(biāo)物成分在液相色譜中能達(dá)到被檢出的要求，故確定取樣量為5 片量。

提取溶劑選擇：分別采用甲醇、乙醇、水、75%的乙醇對樣品進(jìn)行超聲提取，提取率最好的為75%乙醇，結(jié)合天仙子浸膏由70%乙醇浸出而得，故確定以75%乙醇作為提取溶劑。

提取次數(shù)確定：分別采用加75%乙醇溶液40 mL超聲提取2，3，4 次，其中3 次提取與4 次提取無明顯差異。

提取時(shí)間確定：分別采用三氯甲烷超聲提取20 s，30 s，1 min，1.5 min，1 min 與1.5 min，結(jié)果無明顯差異。

三氯甲烷提取次數(shù)確定：分別采用三氯甲烷10，15，20 mL 分別提取5 次，15 mL 與20 mL 無明顯差異。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n=9）

表4 14 批胃痛寧片中天仙子浸膏含量測定結(jié)果（μg/片）

3.2 色譜條件選擇

流動相選擇：分別采用甲醇-乙腈-30 mmol/L 醋酸鈉緩沖液（含0.02%三乙胺、0.3%四氫呋喃，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至6.0）（10 ∶5 ∶85，V/ V/ V）為流動相；甲醇為流動相A，乙腈為流動相B，0.1%磷酸溶液為流動相C 進(jìn)行梯度洗脫；乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液（含0.02%的三乙胺）為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液（含0.02%的三乙胺）為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫對各成分的分離效果最好。

色譜柱選擇：選用Diamonsil（鉆石）200 mm，Agilent Zorax SB，SunFire C18柱3 根色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果各組分出峰順序一致，分離度均達(dá)到要求，相較SunFire 色譜柱分離效果更好。

峰純度測定：采用Waters e2998 DAD 檢測器對目標(biāo)峰進(jìn)行了峰純度測定，結(jié)果純度角度均小于純度閾值，證明峰純。

3.3 含量測定結(jié)果分析

采用該方法對14 批次樣品中天仙子的含量測定結(jié)果顯示，11 批次檢出的氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品含量較高，但各批次之間含量有差異。其中有3 批次來源于2 個廠家測得的含量較低。分析可能原因：因天仙子為毒性成分，廠家在投料時(shí)對其有寧少投而不多投之疑；天仙子浸膏含量本身較低，且目前現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)對天仙子的含量測定指標(biāo)監(jiān)控還是盲點(diǎn)；由于胃痛寧的生產(chǎn)工藝等原因（如生產(chǎn)過程中混料不均），可能導(dǎo)致天仙子含量偏低。因此，對胃痛寧片中天仙子浸膏的含量監(jiān)控很有必要，應(yīng)督促生產(chǎn)廠家購買藥材或投料時(shí)提前對天仙子浸膏的含量測定進(jìn)行監(jiān)控，從而保證藥品質(zhì)量。