基于指紋圖譜分析和多成分同時定量的玉屏風(fēng)丸質(zhì)量評價

王巧清

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900 醫(yī)院，福建 福州 350000）

玉屏風(fēng)丸由黃芪、炒白術(shù)及防風(fēng)3 味中藥材加工而成，具有益氣、固表、止汗功效，主要用于表虛不固、自汗惡風(fēng)，面色白，或體虛易感風(fēng)邪者，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第一冊）》[1]。目前，相關(guān)研究多集中于玉屏風(fēng)顆粒劑及散劑等的質(zhì)量控制[2-3]。作為中醫(yī)藥經(jīng)典劑型，丸劑具有代表性和傳承性，玉屏風(fēng)丸在胃腸道中溶散緩慢，藥效持久，發(fā)揮藥效“緩而不遲”，且方便服用、攜帶和貯存。復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究在于多味藥材的多成分含量測定，而中藥指紋圖譜正是利用其“整體性”及“模糊性”的特點，全面反映中藥化學(xué)的相關(guān)性，整體評價其質(zhì)量。中藥指紋圖譜具有同時、高效、定性定量分析的特點，已廣泛運用到中藥復(fù)方多類多成分研究領(lǐng)域[4-6]。為了更全面、有效地評價玉屏風(fēng)丸的質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立了玉屏風(fēng)丸指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析，對各色譜峰所代表的化學(xué)成分進行了初步歸屬，建立同時測定其7 個主要成分指標(biāo)（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）的定量檢測方法，以期為系統(tǒng)和準(zhǔn)確評價其質(zhì)量提供技術(shù)參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀，包括2695 型四元梯度泵、2695 型自動進樣器、2489 型紫外可見光檢測器、Empower3 色譜工作站，美國沃特世公司）；AUW-220D 型電子天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500W）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（calycosin7-O-β-D-glucopyranoside，批號為111920-201606，含量97.6%），芒炳 花 素（formononetin，批 號 為111703-201504，含 量100%），升麻素苷（prim-O-glucosylcimifugin，批號為111522-201712，含量96.2%），升麻素（cimifugin，批號為 111710-200602，含量 95.5% ），白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ，批號為 111978-201501，含量99.9% ），白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ，批號 為111976-201501，含量 99.9% ）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（atractylenolide Ⅰ，批 號 為 111975-201501，含 量99.9%），各對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（美國Merck 公司）均為色譜純；磷酸為分析純；水為娃哈哈純凈水。玉屏風(fēng)丸（市售，14 批，編號為S1 ～S14，S1 ～S10 為山西華康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為6 g×10 袋/盒，批號分別為20171212，20180105，20180207，20180313，20180408，20180518、20180626，20180912，20181019，20181115；S11 ～S14 為廈門福滿藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為6 g×18 袋/盒，批號分別為180906，181022，181108，181201）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7 -9]

色譜柱：Shim-pack VP-ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～20 min 時12%A，20 ～40 min 時12%A→35%A，40 ～46 min 時35%A→68%A，46 ～50 min 時68%A→80%A，50 ～60 min 時80%A→12%A）；波長：300 nm（0 ～2 min，升麻素苷），254 nm（20 ～40 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素及升麻素），220 nm（40 ～46 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ），275 nm（46 ～60 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）；柱溫：35 ℃；流速：0.85 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品各適量，精密稱定，以85%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.786 6，0.411 2，0.434 7，0.310 8，0.379 5，0.264 5，0.200 3 mg/mL 的混合對照品溶液。取裝量差異項下的樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取粉末約3.0 g，精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入85%甲醇溶液35 mL，室溫超聲處理（功率為450 W，頻率為40 kHz）45 min 后取出，放冷，用85%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。均室溫避光保存。

2.3 指紋圖譜的建立及分析

2.3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗：取同一批（批號為20180912）樣品，按

2.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參比峰，計算得各相對峰面積的RSD均小于0.8%（n=6），共有峰相對保留時間的RSD均小于0.6% （n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20180912）樣品，按2.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參比峰，計算得各相對峰面積的RSD均小于1.2%（n=6），共有峰相對保留時間的RSD均小于0.9%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20180912）樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，4，8，12，16，20，24 h 時進樣，記錄色譜圖。結(jié)果以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參比峰，計算得各相對峰面積的RSD均 小 于1.0% （n=7），共 有 峰 相 對 保 留 時 間 的RSD均小于0.7% （n=7），表明玉屏風(fēng)丸供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

按2.2 項下方法制備14 批供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1 至圖3。將14份指紋圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A 版）軟件，以S4 號玉屏風(fēng)丸供試品溶液的指紋圖譜作為參照圖譜，設(shè)定時間窗寬度為0.3，采用多點校正全譜匹配，生成指紋圖譜共有模式，并計算各圖譜與共有模式的相似度。結(jié)果14 批樣品的指紋圖譜中，共得到18 個共有峰，14 批指紋圖譜的相似度分別為0.994，0.995，0.999，0.998，0.997，0.996，0.991，0.993，0.992，0.995，0.989，0.979，0.988，0.990，均 大 于0.97。

圖1 14 批樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜

圖2 玉屏風(fēng)丸高效液相色譜對照品指紋圖譜

2.3.3 部分共有峰指認(rèn)及相對峰面積計算

將指紋圖譜與2.3.2 項下混合對照品溶液色譜圖進行比對，以保留時間為評價指標(biāo)，指認(rèn)出共有峰中7 種化合物，分別為4 號（升麻素苷）、9 號（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、10 號（升麻素）、11 號（芒柄花素）、16 號（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）、17 號（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）和18 號（白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ），其保留時間 平 均 值 分 別 為13.18，28.04，30.11，31.96，44.02，45.89，47.95 min。其中9 號峰信號最強，位置居中，選為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積。結(jié)果見表1。

2.4 含量測定

2.4.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察及檢測限和定量限測定：分別精密吸取2.2 項下混合對照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各組分對照品進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組分線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。取2.2 項下混合對照品溶液，用85%甲醇逐步稀釋，按各組分色譜峰信噪比（S/ N）=3 ∶1 及10 ∶1 分別測定其檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果見表2。

精密度試驗：取混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

表1 14 批玉屏風(fēng)丸（S1 ～S14）共有峰的相對峰面積

表2 玉屏風(fēng)丸中7 個組分含量測定方法學(xué)考察結(jié)果

圖3 混合對照品溶液高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20180912）樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于0，3，6，9，12，18，24 h 時進樣，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20180912）樣品6 份，按2.2 項方法平行制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為20180912）已知含量玉屏風(fēng)丸粉末6 份，每份1.5 g，精密稱定，置具塞棕色容量瓶中，精密加入含毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.214 7 mg/mL、芒柄花素0.310 9 mg/mL、升麻素苷0.341 1 mg/mL、升麻素0.235 3 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.290 6 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ0.199 9 mg/mL 和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ0.154 7 mg/mL的混合對照品溶液2.0 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，搖勻，濾過，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算各組分加樣回收率。結(jié)果見表3。

2.4.2 樣品含量測定

取S1 ～S14 號玉屏風(fēng)丸，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法分別計算各成分的含量。結(jié)果見表4。

2.5 系統(tǒng)聚類分析[10 -11]

系統(tǒng)聚類分析作為一種統(tǒng)計分析方法，是在相似性的基礎(chǔ)上收集數(shù)據(jù)來分類。以14 批樣品中18 個共有峰的相對峰面積為變量，采用SPSS 22.0 軟件聚類法中Ward 方法對樣品進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以歐氏距離平方為測度。結(jié)果見圖4。可見，當(dāng)類間距為10 ～25 時，14 批樣品可聚為兩大類，第一類為S3，S9，S4，S5，S1，S6，S8，S2，S10，S7；第二類為S12，S14，S11，S13。第一類均為山西華康藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，第二類均為廈門福滿藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，說明同一廠家產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性較高。

3 討論

3.1 測定目標(biāo)成分選擇

黃芪作為玉屏風(fēng)丸的君藥，占總處方量的60%，具有利水消腫、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效，來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. 的干燥根，主要活性成分為黃酮類（毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素）、異黃酮類及其苷類、皂苷類等化合物[12-13]。方中臣藥防風(fēng)含有色原酮、揮發(fā)油及多糖類等有效成分，其中色原酮類具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種功效，故選取升麻素苷、升麻素作為制劑中防風(fēng)藥材的質(zhì)控指標(biāo)[14-15]。白術(shù)健脾益氣，助黃芪以加強益氣固表之功效，為佐藥，特征成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ及白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在HPLC圖中可清晰分辨[16-17]。

表3 玉屏風(fēng)丸7 組分加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究中對樣品提取方法（超聲、浸漬過夜、回流）、提取溶劑（甲醇、85%甲醇、65%甲醇、55%甲醇）、提取時間（25，35，45 min）、流動相（甲醇、乙腈作為有機相，水、0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、0.5%磷酸溶液、0.5%冰醋酸作為水相）、柱溫（25，30，35 ℃）進行了詳細(xì)考察，結(jié)果顯示，85%甲醇作溶劑，超聲處理45 min，柱溫35 ℃，流動相為乙腈-0.5%磷酸溶液梯度洗脫時基線平穩(wěn)，保留時間適中，指紋圖譜色譜峰數(shù)量多且分離效果佳，各色譜峰峰形好。采用DAD 檢測器在190 ～400 nm 波長處掃描，為使各成分均在其最大吸收波長下進行測定，采用不同時段切換不同檢測波長：0 ～20 min時設(shè)定檢測波長為300 nm，測定升麻素苷；20 ～40 min時設(shè)定檢測波長為254 nm，檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素及升麻素；40 ～46 min 時設(shè)定檢測波長為220 nm，檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；46 ～60 min 時設(shè)定檢測波長為275 nm，檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。

表4 玉屏風(fēng)丸中7 組分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

圖4 14 批玉屏風(fēng)丸聚類分析樹狀圖

3.3 方法評價

基于中成藥的質(zhì)量控制的特點，本研究中建立了玉屏風(fēng)丸指紋圖譜，實現(xiàn)了對其多指標(biāo)成分進行整體綜合的客觀評價與分析，保證藥效的穩(wěn)定性；同時又建立毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量測定方法，實現(xiàn)玉屏風(fēng)丸的定量分析。該方法前處理條件簡便、快捷，測定結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、實用性強，同時具備定性和定量雙重評價功能，可有效控制玉屏風(fēng)丸的質(zhì)量。