脾腎兩助丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張衛(wèi)蓮，曹蓉蓉，劉繼青，陳 浩

（陜西省榆林市藥品檢驗(yàn)所，陜西 榆林 719000）

脾腎兩助丸由黨參、山藥、黃芪、白芍、熟地黃、山茱萸等30 味中藥材組方，為黑褐色的大蜜丸，味甜、微酸，臨床用于治療脾腎虛弱而致的肢體倦怠、氣虛無(wú)力、腰痛腰困、頭昏耳鳴等癥狀。本品收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第八冊(cè)）》（WS3-B-1654-93，Z8-192），標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀、顯微及檢查項(xiàng)，缺少薄層鑒別和含量測(cè)定，不利于產(chǎn)品的系統(tǒng)研究和內(nèi)在質(zhì)量控制。本研究中通過(guò)對(duì)脾腎兩助丸的研究，并結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)[1-13]，制訂了該復(fù)方制劑中黃芪、白芍指標(biāo)性成分的薄層色譜（TLC）定性鑒別方法及山茱萸中有效成分莫諾苷、馬錢(qián)苷的高效液相色譜（HPLC）定量檢測(cè)方法，旨在更好地控制脾腎兩助丸的質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），包括Agilent open LAB CDS chemstation 色譜工作站，VWD 紫外檢測(cè)器；MS205DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司，精度為十萬(wàn)分之一）；AS5150A 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為180 W）。

1.2 試藥

莫諾苷對(duì)照品（批號(hào)為111998-201703），馬錢(qián)苷對(duì)照品（批號(hào)為111640-201604），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-200613），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201640），白芍對(duì)照藥材（批號(hào)為0905-200508），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；水為超純水；硅膠G 板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；脾腎兩助丸（批號(hào)分別為20170401，20170801，20171101，規(guī)格為每丸9 g）及陰性樣品均由山西華康藥業(yè)股份有限公司提供；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別

黃芪：取脾腎兩助丸18 g，剪碎，加硅燥土6 g，研勻，加甲醇50 mL，超聲（180 W，40 kHz）30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至20 mL，加在中性氧化鋁柱（100 ～200 目，4 g，內(nèi)徑1.0 ～1.5 cm）上，用40%甲醇80 mL 洗脫，將洗脫液蒸干，加水30 mL 溶解殘?jiān)?，用水飽和過(guò)的正丁醇萃取3 次，每次15 mL，合并正丁醇液，再用氨試液洗滌2次，每次25 mL，棄去氨試液，取正丁醇液，蒸干，用甲醇2 mL 溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品5 mg，精密稱(chēng)定，加5 mL 甲醇溶解，制成對(duì)照品溶液。按處方比例和工藝，制成缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》TLC 法（通則0502）試驗(yàn)，吸取以上3 種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-水-甲醇（13 ∶2 ∶7）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光與紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，均有黃芪甲苷的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖1 A）。

圖1 薄層色譜圖

白芍：取黃芪定性鑒別項(xiàng)下的供試品溶液。另取白芍對(duì)照藥材1 g，加乙醇20 mL，振搖5 min，過(guò)濾，濾液蒸干，用乙醇1 mL 溶解殘?jiān)?，制成?duì)照藥材溶液。再取芍藥苷對(duì)照品5 mg，加乙醇5 mL，溶解，制成對(duì)照品溶液。按處方比例和工藝，制成缺白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》TLC 法（通則0502）試驗(yàn)，吸取以上4 種溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-甲酸（40 ∶10 ∶5 ∶0.2，V/ V/ V/ V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，供試品溶液色譜中，均有芍藥苷及白芍藥材的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖1 B）。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient-5-TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為3 mL/L 磷酸，梯度洗脫（0 ～5 min 時(shí)5%A，5 ～20 min 時(shí)8%A，20 ～35 min 時(shí)20%A，35 ～45 min 時(shí)60%A，45 ～55 min 時(shí)60%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

2.2.2 溶液制備

取供試品，剪碎，取2.0 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（180 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取莫諾苷對(duì)照品（標(biāo)示量為97.4%）10.42 mg 和經(jīng)P2O5減壓干燥12 h 的馬錢(qián)苷對(duì)照品9.36 mg，精密稱(chēng)定，分別置10 mL 容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成對(duì)照品溶液。按照脾腎兩助丸的處方比例和工藝取缺山茱萸的藥材制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別取上述3 種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果在莫諾苷對(duì)照品、馬錢(qián)苷對(duì)照品色譜峰位置上，陰性樣品不出峰，表明陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖2。

線(xiàn)性關(guān)系考察：取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液作為對(duì)照品母液，逐級(jí)稀釋成每1 mL 含莫諾苷40.60，20.30，10.15，5.07，2.54，1.27 μg，含馬錢(qián)苷37.44，18.72，9.36，4.68，2.34，1.17 μg 的對(duì)照品梯度溶液。分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，莫諾苷和馬錢(qián)苷線(xiàn)性回歸方程分別為Y莫=18.43869X-0.84240（r=0.9999）和Y馬=18.00140X-0.466 17（r=0.999 9）。結(jié)果表明，莫諾苷和馬錢(qián)苷質(zhì)量濃度在1.269 ～40.596 μg/mL（n=6）和1.170 ～37.440 μg/mL（n=6）范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n=6）

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果莫諾苷和馬錢(qián)苷的RSD分別為0.20%和0.05%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20170801）樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，在擬訂色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果莫諾苷和馬錢(qián)苷的平均含量分別為0.300 5，0.293 2 mg/mL，RSD均為0.36%，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性考察：取同一供試品溶液（批號(hào)為20170801），在擬訂色譜條件下，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果莫諾苷和馬錢(qián)苷的RSD分別為0.18% 和0.68%，表明兩者在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)20170801）1.0g，剪碎，精密稱(chēng)定，加入莫諾苷對(duì)照品溶液1 014.9 μg/mL 0.3 mL 和馬錢(qián)苷對(duì)照品溶液936.0 μg/mL 0.31 mL，按供試品溶液制備方法制備，平行制備6 份，按擬訂色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

取3 批脾腎兩助丸，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法分別計(jì)算含量。結(jié)果莫諾苷的含量分別為0.354 4，0.300 5，0.352 4 mg/g（n=6）；馬錢(qián)苷的含量分別為0.287 0，0.293 2，0.284 0 mg/g（n=6）。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

取供試品，剪碎，取2.0 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，分別精密加入4 種不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶解（50%甲醇，70%甲醇，80%甲醇，甲醇）各25 mL，超聲（180 W，40 kHz）30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，依法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，用50%甲醇提取，莫諾苷和馬錢(qián)苷測(cè)定的峰面積最大，提取最完全，且分離度符合要求。

3.2 提取方法選擇

取供試品，剪碎，取2.0 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入優(yōu)選的溶劑50%甲醇25 mL，分別用7 種不同方法提取：超聲30 min；超聲45 min；超聲60 min；超聲15 min+回流1 h；回流1 h；超聲30 min+回流30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液；回流1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱（100 ～200 目，4 g，內(nèi)徑1.0 ～1.5 cm）上，用40%甲醇80 mL 洗脫，將流出液及洗脫液蒸干，用50%甲醇2 mL 溶解殘?jiān)?，?0 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度。試驗(yàn)結(jié)果表明，7 種提取工藝方法所測(cè)得含量無(wú)明顯差異，故提取方法采用超聲（180 W，40 kHz）30 min，方法簡(jiǎn)便，時(shí)間短，且提取完全。

黃芪、白芍的TCL 鑒別項(xiàng)中，通過(guò)改進(jìn)2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]中的提取方法，可得到斑點(diǎn)清晰、專(zhuān)屬性好的色譜圖，且陰性對(duì)照驗(yàn)證了鑒別方法的可行性。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相選擇

HPLC 含量測(cè)定項(xiàng)中，文獻(xiàn)中同時(shí)測(cè)定山茱萸中馬錢(qián)苷和莫諾苷的含量大多采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)法[2-3]，而本研究中對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，采用單波長(zhǎng)240 nm檢測(cè)。以乙腈-3 mL/L 磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫，所有組分的出峰時(shí)間均在35 min，且分離度好。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中所建立的黃芪、白芍的TLC 鑒別方法，以及莫諾苷和馬錢(qián)苷HPLC 含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，分離度好，可用于脾腎兩助丸的質(zhì)量控制。