高效液相色譜法測定復方夏天無片中原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿含量

陳 芳，李 倩，李學英

（山東省德州市中醫院腦病科，山東 德州 253000）

復方夏天無片是由夏天無、夏天無總堿、制草烏、人工麝香等中藥組方，具有祛風逐濕、舒筋活絡等功效，可用于風濕瘀血阻滯、經絡不通引起的關節腫痛、肢體麻木、屈伸不利、步履艱難，臨床常用于治療風濕性關節炎、坐骨神經痛、腦血栓形成后遺癥及小兒麻痹后遺癥見上述證候者[1-6]。2015 年版《中國藥典（一部）》中復方夏天無片含量測定僅檢測原阿片堿的含量[7]，用于表征夏天無和夏天無總堿的量，缺少制草烏中苯甲酰烏頭原堿的含量測定，不能較好地控制制劑質量。本研究中建立了檢測復方夏天無片中的原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿含量的高效液相色譜（HPLC）法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀，包括Waters 2998 DAD 型檢測器（美國沃特世科技公司）；Agilent Zorbax Eclipse SB-C18色譜柱（美國安捷倫科技公司）；XS 204ME 型電子天平（瑞士梅特勒科技公司）；Milli-Q IQ 7000 型超純水儀（德國默克密理博科技公司）；KQ-300TDE 型超聲波清洗機（昆山舒美超聲設備公司）。

1.2 試藥

復方夏天無片（江西天施康中藥股份有限公司，批號分別為190405，180721，181215，規格為每片0.32 g）原阿片堿對照品（批號為110853-201805，含量為99.6%），苯甲酰烏頭原堿對照品（批號為111794-201705，含量為99.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（美國Fisher 集團）均為色譜純；乙酸銨、冰乙酸、磷酸（上海化學試劑廠）均為分析純；超純水（自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：0.1%冰乙酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～5 min 時94%A，5 ～27 min 時94%A→58%A，27 ～30 min 58%A →94%A，30 ～35 min 94%A）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：264 nm；進樣量：25 μL。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿標準品各25.0 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加1%鹽酸溶液5.0 mL及甲醇溶液12.0 mL，超聲溶解，取出，放冷，加70%甲醇至刻度（每1 mL 含原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿均為0.5 mg），搖勻，即得混合對照品溶液。取復方夏天無片樣品10 片，研細，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇約40 mL，超聲提取（功率為300 W，頻率為60 Hz）約25 min；取出，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。按處方和工藝制備缺夏天無、夏天無總堿和制草烏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2 項下3 種溶液和試劑空白溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結果表明，在該色譜條件下，供試品溶液色譜中各被測組分峰分離良好，且陰性對照無干擾，方法專屬性良好。

線性關系考察：取混合對照品溶液適量，制成質量濃度為0.25，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的標準溶液，加70 %甲醇至刻度，搖勻，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿的質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿的回歸方程分別為Y原=16.109X+8.763（r=0.999 5）和Y苯=212.095X+11.689（r=0.999 6）。結果表明，原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿質量濃度均在0.25 ～10.0 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取混合對照品溶液（質量濃度為0.5 μg/mL），按擬訂色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。結果原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿峰面積的RSD分別為2.08%和2.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試樣品（批號為180721）溶液，室溫下放置0，3，6，9，12，24 h，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿峰面積的RSD分別為2.33%和2.97%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為180721）10 片，研細，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，分別精密稱取6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿峰面積的RSD分別為2.63%和3.65% （n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為180721）10 片，研細，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，分別取6份，精密稱定，分別加入混合對照品溶液適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取復方夏天無片（批號分別為190405，180721，181215），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定峰面積，并計算樣品含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 測定波長選擇

取原阿片堿對照品，配制質量濃度為10.0 μg/mL的標準溶液，加70 %甲醇至刻度，搖勻，即得波長測試溶液，依法配制苯甲酰烏頭原堿波長測試溶液。開啟紫外可見分光光度計，在200 ～400 nm 波段對上述溶液分別進行光譜掃描。結果原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿分別在236 nm 和290 nm 波長處有最大吸收，為使2 種待測成分有較好的響應，本研究中選擇264 nm 作為檢測波長。

3.2 提取溶劑選擇

復方夏天無片中待測成分提取溶劑的選擇是影響檢測結果準確度和基質干擾情況的重要因素。本研究中分別考察了乙腈、甲醇、95%甲醇、70%甲醇作為提取溶劑樣品中原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿提取率的影響。結果選擇70%甲醇作為提取溶劑時，2 種待測成分提取率高，且基質干擾小。

綜上所述，該方法操作簡便、準確、重復性好，可用于同時測定復方夏天無片中原阿片堿和苯甲酰烏頭原堿的含量。