基于雙硫鍵的谷胱苷肽熒光傳感器分子制備

張曉琳，喬威威，馬思陽

（大連大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

一、引言

谷胱苷肽幾乎存在于身體的每一個細胞，是細胞內重要的調節代謝物質，對維持人體內正常的免疫系統及生化防御體系不可或缺，能夠實時快速實現谷胱苷肽的檢測，對疾病的監控以及早期診斷治療具有重要意義[1,2]。熒光傳感器檢測靈敏度高、實時快捷，已經廣泛應用于生物以及臨床醫學等各個領域。近十年來，以谷胱苷肽為目標分子的熒光傳感器屢見報道，但目前報道的大部分的熒光傳感器主要是用熒光強度的強弱來實現谷胱苷肽的熒光檢測[3-5]。相比于單純依賴熒光強度檢測的傳感器，基于熒光共振能量轉移（FRET）的熒光傳感器可以應用內部兩種不同發射波長的比值來檢測目標，避免了儀器、生物環境、傳感器濃度以及生物體內自發熒光干擾，越來越受到研究人員的青睞[6-8]。

熒光共振能量轉移（FRET）機理是采用兩個能量匹配的熒光團分別做為熒光供體和熒光受體，通過適宜的連接方式實現雙波長熒光檢測，是在生物體內進行目標分子比率熒光檢測的重要方法[9-11]。但如何在同一分子中即實現谷胱苷肽的靈敏性響應，同時又實現兩個不同的熒光團的能量匹配，最終將谷胱苷肽的濃度以可視化的熒光釋放出來，這對分子設計和合成均帶來了一定的難度[12,13]。

雙硫鍵對谷胱苷肽十分敏感，在谷胱苷肽的存在下，能夠發生雙硫鍵的斷裂[14-16]。本文通過精密的分子設計，以雙硫鍵作為谷胱苷肽識別位點，基于熒光共振轉移機理設計了以丹磺酰胺和香豆素熒光團[17]為供受體系的比率熒光分子探針。其中丹磺酰胺和香豆素熒光團能量匹配[18]，光物理性質優良，以其作為熒光供受體的熒光共振能量轉移熒光探針來識別谷胱苷肽將對生物體內谷胱苷肽的識別提供更多有價值的信息。

二、實驗部分

（一）分子設計

圖1 熒光傳感器的分子識別示意圖

香豆素熒光團發射波長在藍光區，此波段正好處于丹磺酰胺的特征吸收區，因此香豆素和丹磺酰胺能量匹配，適合于制備FRET 的熒光分子探針。為了實現與谷胱苷肽識別后的熒光變化，目標分子通過含有雙硫鍵的長鏈將熒光供體香豆素和熒光受體丹磺酰胺連接，當識別谷胱苷肽前，該分子中兩個熒光團處于一個分子中，當激發香豆素熒光團時，由于香豆素和丹磺酰胺熒光團發生熒光共振能量轉移，此時只有丹磺酰胺黃色熒光能夠釋放出來。當體系中存在谷胱苷肽后，雙硫鍵發生斷裂，此時熒光團香豆素和丹磺酰胺分子，距離變遠，超出熒光共振能量轉移發生的范圍，當激發香豆素熒光團時，只有香豆素的藍色熒光能夠釋放出來。

（二）合成路線

圖2 化合物的合成路線

本文以4－二乙基胺水楊醛作為原料，通過縮合成環生成香豆素羧酸，再進一步與氯化亞砜反應成香豆素酰氯化合物c。丹磺酰氯則通過與含有雙硫鍵的二胺高效合成中間體化合物D-S，再進一步與化合物c 利用高效地酰胺合成生成最終目標分子D-S-CR。合成路線中原料易得，合成高效。

三、化合物制備

（一）化合物c 的合成

4－二乙基氨基水楊醛(7.72 g，0.04 mol)，丙二酸二乙酯(12.8 g，0.08 mol)和哌啶(4 mL)在無水乙醇(120 mL)中混和。混合液在82 ℃條件下攪拌回流6 h。冷卻到室溫，再加入質量百分比為10%的NaOH 溶液60 mL，回流15 min 使此反應水解。混合液冷卻到室溫，用pH=2 的濃鹽酸在冰浴的條件下酸化，得到晶狀沉淀。過濾，洗滌，真空干燥，在乙醇中重結晶。得到6.93 g 純品化合物b，產率66.6%。

取50 mL 小瓶，把化合物b 加于氯化亞砜中，常溫攪拌，反應2 h 后，冰水浴冷卻，慢慢滴加0.1 mol/L NaOH 溶液至中性，在通風廚中抽濾，用乙醚洗滌沉淀，得到5.64 g 黃色固體化合物c，產率為76%，所得粗產品未經處理直接進行下步反應。

（二）化合物D-S 的合成

取100 mL 小瓶，胱胺二鹽酸(2.09 g，9.25 mmol)鹽溶于二氯甲烷中，加入3 倍量的三乙胺，慢慢滴入丹磺酰氯(500 mg，1.85 mmol)的二氯甲烷溶液。常溫攪拌，點板確定反應終點。過濾，柱層析分離(V二氯甲烷:V甲醇=100:1，Rf=0.5)，進行分類純化，旋蒸。得到化合物D-S 固體438 mg，產率63.48%，化合物D-D 固體319 mg，產率28.80%。

D-S:1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ= 8.47 (d, 1H, J = 8.5 Hz, -ArH), 8.28 (d, 1H, J = 8.5 Hz, -ArH), 8.13 (d, 1H, J = 7.0 Hz, -ArH), 8.10-8.28 (寬峰, 3H, -NH2 and -NH-), 7.59-7.66 (m, 2H, -ArH), 7.27 (d, 1H, J = 7.5 Hz, -ArH), 3.02-3.10 (m, 4H, -CH2-), 2.84-2.87 (m, 8H, 2H for -CH2- and 6H for -CH3), 2.69 (t, 2H, J = 6.8Hz, -CH2CH2-).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) : δ=151.9, 136.3, 130.0, 129.5, 129.4, 128.7, 128.4, 124.1, 119.6, 115.7, 45.6, 42.1, 38.2, 37.8, 34.3.

（三）化合物D-S-CR 的合成

化合物D-S(200 mg，0.52 mmol)溶于二氯甲烷中，加入等摩爾量的三乙胺(72 μL，0.52 mmol)慢慢滴入等摩爾量的化合物c(145 mg，0.52 mmol)的二氯甲烷溶液，常溫攪拌，點板確定反應終點。柱層析分離(V二氯甲烷:V甲醇=50:1，Rf=0.75)，實時點板跟蹤，立即減壓蒸餾得到純產物,收率65%。在核磁管中加入產物D-S-CR，用氘代氯仿(CDCl3)溶解，做核磁共振，做出氫譜和碳譜圖。1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ= 9.04 (s, 1H, -NH), 8.74(s, 1H, -ArH), 8.55 (s, 1H, -NH), 8.40 (d, 1H, J = 7.5 Hz, -ArH), 8.27 (d, 1H, J = 7.0 Hz, -ArH), 7.54 (m, 2H, -ArH), 7.44 (d, 1H, J = 9.0 Hz, -ArH), 7.18 (d, 1H, J = 6.5 Hz, -ArH), 6.65 (d, 1H, J = 9.0 Hz, -ArH), 6.52 (s, 1H, -ArH), 6.12 (m, 1H, -ArH), 3.66 (t, 2H, J = 6.5 Hz, -CH2CH2-), 3.46 (m, 4H, J = 7.0 Hz -CH2CH3), 3.27 (t, 2H, J = 6.0 Hz, -CH2CH2-), 2.89 (s, 6H, -CH3), 2.77 (t, 2H, J = 6.5 Hz, -CH2CH2-), 2.69 (t, 2H, J = 6.0 Hz, -CH2CH2-), 1.25 (t, 6H, J = 6.0 Hz, -CH2CH3). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ= 163.6, 162.8, 157.7, 152.7, 148.5, 135.3, 131.4, 130.3, 129.8, 129.6, 129.5, 128.3, 123.2, 119.2, 115.3, 110.1, 109.7, 109.2, 108.4, 96.6, 45.6, 45.1, 41.7, 38.7, 38.6, 37.4, 12.4. TOF MS calcd for C30H36N4O5S3628.1848, found 628.1590.

四、結果和討論

（一）熒光顏色變化

將化合物D-S-CR 配制成10-5mol/L 的溶液(V乙醇:V水＝1:1)，當加入100 倍谷胱苷肽前后，明顯看到溶液熒光由綠色變為藍色熒光。這說明當加入谷胱苷肽后，雙硫鍵發生斷裂，兩個熒光團之間距離的變遠，使熒光共振能量轉移關閉。此時只有丹磺酰胺的黃色熒光能夠釋放出來。這說明香豆素和丹磺酰胺能量匹配，適合于制備FRET 的熒光分子探針。當識別谷胱苷肽前，該分子中兩個熒光團處于一個分子中。激發香豆素熒光團時，由于香豆素和丹磺酰胺熒光團發生熒光共振能量轉移，此時只有丹磺酰胺綠色熒光能夠釋放出來。當體系中存在谷胱苷肽后，雙硫鍵發生斷裂，此時熒光團香豆素和丹磺酰胺分子距離變遠，超出熒光共振能量轉移發生的范圍，當激發香豆素熒光團時，只有香豆素的藍色熒光能夠釋放出來。

（二）化合物吸收光譜

將目標分子配制成10-5mol/L 溶液(V乙醇:V水＝1:1)測試其紫外吸收光譜。從圖3 中可以看出，D-S的紫外吸收的摩爾消光系數很小，所以在目標分子D-S-CR 的紫外吸收光譜中只能明顯看到415 nm 處的吸收峰，這個峰為香豆素的特征吸收峰，說明這兩個熒光團在基態時并沒有發生相互作用。

圖3 化合物D－S、D－S－CR 和香豆素單體的吸收光譜

五、結論

本論文設計并合成基于熒光共振能量轉移機理的谷胱苷肽熒光傳感器D-S-CR，并通過核磁氫譜、碳譜以及質譜鑒定。熒光傳感器D-S-CR 以雙硫鍵作為谷胱苷肽識別位點，以藍色熒光團香豆素衍生物作為熒光供體，黃色熒光團丹磺酰胺作為熒光受體，通過調節兩個不同能量熒光團在識別谷胱苷肽前后距離的變化，實現了熒光傳感器D-S-CR 識別谷胱苷肽后熒光從黃到藍的可視化檢測。熒光傳感器D-S-CR 在谷胱苷肽比率熒光檢測中具有良好的應用前景，有望對生物體內谷胱苷肽的識別提供更多有價值的信息。