股骨頭壞死的代謝組學(xué)研究進展

先丹丹，盧發(fā)強

（大連大學(xué) 附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116001）

股骨頭壞死即缺血性骨壞死(Avascular Necrosis of the Femoral Head，AVNFH)，是由于股骨頭的血供受損或者中斷，引發(fā)的骨細胞及其骨髓成分凋亡，隨后組織進行修復(fù)，最終使股骨頭的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至出現(xiàn)塌陷和髖關(guān)節(jié)破壞，從而引發(fā)一連串病理生理改變和臨床表現(xiàn)[1,2]。該病是骨科的常見疾病，美國有30 萬至60 萬人患有非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(Non-traumatic Osteonecrosis of the Femoral Head，NONFH)，從20 世紀90 年代開始，美國平均每年增加1 萬至2 萬的新病例[3-5]。根據(jù)在2012 年6 月至2013 年8 月選出的代表性樣本中，我國NONFH的總體患病率是0.725%[6]。按照我國最新人口調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，15 歲以上人群(包括15 歲)中有800 多萬人口患有NONFH[7]。ONFH 可分為創(chuàng)傷性股骨頭壞死和NONFH。前者的病因明確，后者主要包括長期大量使用激素、長期飲酒、凝血功能障礙、自身免疫性疾病等[8]。但是ONFH 的發(fā)生機制目前還未完全明確，各國學(xué)者提出了多種理論：脂質(zhì)代謝紊亂理論、血管內(nèi)凝血理論、基因多態(tài)性理論、骨內(nèi)壓增高理論、骨質(zhì)疏松理論等[9,10]。由于ONFH的自然進程較快，如果不進行早期診斷和治療，最終患者需要進行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，嚴重影響患者生活質(zhì)量水平。該病的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、體征及影像學(xué)檢查(X 線、CT、MRI 等)，但X 線、CT 不足以用于早期診斷，MRI 用于早期診斷有較好的靈敏度，但是其價格昂貴，故較難用于早期篩查，導(dǎo)致ONFH 早期診斷較為困難[11]。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要構(gòu)成部分，是近年來飛速成長的一門新技術(shù)，被廣泛用到疾病診斷[12]、藥理學(xué)[13]、營養(yǎng)學(xué)[14]、微生物學(xué)[15]、食品科學(xué)[16]等各個領(lǐng)域，在生命科學(xué)領(lǐng)域中表現(xiàn)出巨大的作用。將代謝組學(xué)用于ONFH 的研究，有利于該病的早期診斷。

一、代謝組學(xué)概念

隨著后基因時代的到來，人們對生命有了更加深刻的認識，研究重點慢慢轉(zhuǎn)移到幾個組學(xué)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))上來，他們共同構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)。Nicholson 等[17]認為基因以及蛋白質(zhì)組學(xué)忽略了生物體內(nèi)的動態(tài)代謝情況，因此在20 世紀90 年代末提出了一種基于NMR 的“代謝組學(xué)”技術(shù)，將其定義為“定量測定由于機體受到各種病理生理干擾或者遺傳變化而造成的動態(tài)代謝反應(yīng)”。后來常將代謝組學(xué)解釋為通過檢測生物體受到內(nèi)外環(huán)境干擾或變化后，其代謝物的種類、量以及規(guī)律發(fā)生改變，從而探索生物體的一門科學(xué)[18]。代謝處于生命調(diào)控的尾端，上游生物的破壞可導(dǎo)致下游一系列代謝物發(fā)生變化，因此，代謝組學(xué)擁有大量的信息，較其他組學(xué)而言，更接近于表型，因此它的最終目標是盡可能地全盤解析體內(nèi)的小分子代謝物。該組學(xué)可以分成兩種方法[19,20]，即靶向和非靶向代謝組學(xué)。非靶向是盡可能對標本中所有可能測到的代謝物進行全盤分析，其中包含未知的，為找到新的靶標給予機會；而靶向代謝組學(xué)旨在對樣本中某一類或幾類特定代謝物進行檢測分析，這有助于降低后續(xù)實驗和數(shù)據(jù)分析偽像的可能性。

二、代謝組學(xué)研究方法

代謝組學(xué)的流程包含了標本的收集及預(yù)處理、數(shù)據(jù)信息的獲取及預(yù)處理、數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析、標志物的鑒別以及對代謝通路的闡述等[21]。將收集的樣本如血漿、血清、尿液、糞便、唾液、胸腹水、腦脊液、組織等進行預(yù)處理，然后運用核磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜(LS-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)或高效液相色譜法(HPLC-MS)等[22]技術(shù)對數(shù)據(jù)信息進行收集，收集完成后不能立刻開始模式識別，需要對其實行預(yù)處理，一般包含峰匹配、去噪、峰對齊、歸一化和標準化等[23]。該技術(shù)獲得的信息是多量的、繁瑣的，為了充分獲取信息，將對數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，主要包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法的主成分(PCA)、非線性映射(NLM)和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等[23]。需要注意的是，監(jiān)督模型建立之后需要進行模型驗證，如置換檢驗、交叉驗證。其中常用的數(shù)據(jù)處理軟件包括SIMCA-P、Sieve、MetaboAnalyst、MarkerLynx、R 軟件等[24-28]。根據(jù)上述分析，可以結(jié)合fold change 值、VIP 值、P 值等來篩選生物標志物。將篩選出的標志物進行數(shù)據(jù)庫檢索，對其進行鑒定，常用的數(shù)據(jù)庫有HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、MassBank (https://massbank.eu/)、LIPID MAPS(http://www.lipidmaps.org/data/structure/)、NIST (http://www.nist.gov/srd/nistl.htm)、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）等[29-34]，同時將所找到的標志物進行代謝途徑分析，從而探索疾病的發(fā)病機制。

三、ONFH 的代謝組學(xué)研究

隨著組學(xué)技術(shù)的日新月異，代謝組學(xué)在臨床上也得到廣泛應(yīng)用。很多專家利用該技術(shù)對ONFH 樣本（血漿、尿液或骨組織等）進行分析。目前，代謝組學(xué)在ONFH 領(lǐng)域的探索主要涉及生物標志物的鑒定、代謝途徑的認識等方面。雖然代謝組學(xué)在ONFH 領(lǐng)域已有一定的發(fā)展，但是，相關(guān)研究仍然面對很多的困難及挑戰(zhàn)。

（一）ONFH 的潛在生物標志物

生物標志物的鑒定和代謝途徑的分析具有協(xié)助疾病診斷及治療，了解預(yù)后和探討發(fā)病機制的潛力。高四川等[35]研究發(fā)現(xiàn)并鑒定出28 種差異性代謝物質(zhì)，同時篩選出三種潛在診斷性生物標志物。Yang G 等[36]篩選出硫酸鹽，尿素，脫氧膽酸和PE[14:0/14:1(9Z)]作為ONFH 的生物標志物。Zhu WW 等[37]的研究基于UPLC-MS/MS 篩選出四種股骨頭壞死的潛在性生物標志物，四者聯(lián)合診斷ONFH 的價值較高。經(jīng)歸納，將相關(guān)文獻中提到的生物標志物歸納總結(jié)于表1[35-38]。ONFH 的生物標記物有利于對疾病進行早期診斷，甚至可以用于對疾病預(yù)后的評估，但是目前該研究還居于初級狀態(tài)，因此還需加大對它的探索。

表1 潛在的生物標志物

保留時間 代謝物 變化趨勢 質(zhì)量 P 值5.61 D-精氨酸 ↑ 174.1116 0.000 7.46 L-脯氨酸 ↑ 115.0633 0.000 7.93 L-谷氨酰胺 ↑ 146.0691 0.000 6.89 L-肉堿 ↑ 162.1051 0.000 6.25 肌苷 ↑ 268.08070.000

（二）ONFH 的代謝途徑

1 核苷酸代謝和嘌呤代謝

核苷酸是核酸(DNA 和RNA) 的基本結(jié)構(gòu)單位。嘌呤分解代謝過程中，次黃嘌呤最終將分解為尿酸，在這個過程中會形成氧自由基，具有組織損傷作用[39]。肌苷是腺苷的分解產(chǎn)物，可顯著減少脂質(zhì)過氧化，并增加了還原型谷胱甘肽(GSH)以及超氧化物歧化酶(SOD)的程度，具有抗炎抗氧化作用[40]。ONFH 患者次黃嘌呤水平降低[35]，肌苷水平升高[38]，這些研究可能說明了ONFH 的發(fā)生與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。

2 氨基酸代謝

甲硫氨酸(蛋氨酸，Met)是體內(nèi)的含硫氨基酸，由于體內(nèi)無法自動合成，需要由食品提供，因此它屬于必需氨基酸。Met 可以轉(zhuǎn)變成其他含硫氨基酸：半胱氨酸以及胱氨酸。在Met 循環(huán)中，它可以在各種酶的協(xié)助下依次形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、同型半胱氨酸(Hcy)、Met。Hcy 主要有兩條代謝途徑，一條是再甲基化途徑：其中轉(zhuǎn)甲基酶的輔酶是VitB12；另一條為轉(zhuǎn)硫途徑，其中以VitB6 為輔酶。因此，Hcy 代謝與VitB12、VitB6 水平密切相關(guān)。Yang J 等[41]發(fā)現(xiàn)Hcy 顯著增加了骨折風(fēng)險。Narayanan A 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，ONFH 的靶向代謝組學(xué)分析揭示了甲硫氨酸-同型半胱氨酸途徑代謝物的變化，ONFH 樣本中Met、SAM、SAH、Hcy 和腺苷水平顯著提高，VitB12 和VitB6 水平下降，這兩種維生素作為Hcy代謝的輔酶，進一步說明了股骨頭壞死患者體內(nèi)Hcy 的積累。Yang G 等[36]研究同樣也表明ONFH與半胱氨酸和蛋氨酸代謝有關(guān)，絲氨酸、硫酸鹽和Hcy 在這一途徑中受到影響。Hcy 可以增加氧化應(yīng)激，破壞膠原分子的交聯(lián)，增加晚期糖基化終產(chǎn)物的水平，從而降低骨強度，增加骨吸收[43]。有研究表明[44-46]，Hcy 水平增高可使破骨細胞活性增加，誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞凋亡。Fitzpatrick 等[47]發(fā)現(xiàn)，靶向破壞小鼠組氨酸脫羧酶(HDC)基因[HDC（-/-）]后，它的破骨細胞數(shù)目降低，骨形成增長而骨吸收降低，骨皮層厚度和礦物質(zhì)含量增長。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是骨代謝尤其是成骨細胞形成的重要調(diào)節(jié)劑，研究表示[48]，精氨酸(Arg)可以刺激鼠成骨樣細胞的IGF-1 和膠原蛋白的形成，通過增強局部IGF-1 的產(chǎn)生來影響骨形成。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)對于骨骼形成非常重要，而缺乏Pyk2(Pyk2-KO)的雌性小鼠則表現(xiàn)出骨含量增長以及骨骼形成速度加快，而破骨細胞活性降低[49]。由此可見，氨基酸代謝在ONFH 的病理生理中有著不可替代的影響。

3 脂類代謝

肉堿具有多種作用，它不僅可以促進脂肪酸的β 氧化，還可以調(diào)控人體中膽固醇(CHOL)的形成和分布，與此同時它還可以改變脂蛋白的成分及比例[50]。研究發(fā)現(xiàn)[51]，左旋肉堿(LC)增強了線粒體的活性并改善了成骨樣細胞的抗氧化能力，同時LC 增加了Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ，此外，LC 誘導(dǎo)ERK1/2 和AKT 的磷酸化以及成骨細胞分化的主要激酶，并上調(diào)了成骨相關(guān)基因包括核心結(jié)合蛋白因子2(RUNX2)、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)、骨唾液蛋白(BSP)、骨橋蛋白(OPN)等，這些都提示了LC 對成骨因子起著上調(diào)作用。在ONFH 的研究中，發(fā)現(xiàn)肉堿水平升高[37,52]。果糖作為一種單糖，如果過量攝入果糖可能會導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，其中極低密度脂蛋白(VLDL)以及甘油三酯(TG)水平升高[53]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)ONFH 患者果糖代謝水平上調(diào)[35]。甘油磷脂主要包括磷脂酰膽堿(卵磷脂、PC)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂、PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂、DAG)、磷脂酰肌醇(PI)。破骨細胞如果融合不良可能會影響體內(nèi)骨骼的完整性，研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞形成中細胞融合步驟受PS 調(diào)節(jié)的幾種蛋白質(zhì)活性的控制[54]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是肌醇和PI 中的一種重要激酶，Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，啟動PI3K/Akt 細胞信號途徑可以增加成骨細胞的繁殖，分化以及骨形成[55]。ONFH中甘油磷脂代謝受到顯著干擾[36,37,52]，說明甘油磷脂代謝在股骨頭壞死的病理過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。于雪峰等[56]利用代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸代謝發(fā)生異常也是引起ONFH 的緊要原因。由此可見，更好地了解脂質(zhì)代謝變化在ONFH 中的所起的作用，有助于探索疾病的發(fā)病機制，甚至有可能有助于開發(fā)治療該病的新方法。

4 能量代謝

糖酵解途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸后進入線粒體，經(jīng)過氧化脫羧形成乙酰CoA，再經(jīng)過TCA 循環(huán)被完全氧化。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)可以進行自身的更新以及多向分化，它可以分化為成骨細胞、軟骨細胞等等，其中未分化的骨髓間充質(zhì)干細胞獲能主要依靠糖酵解代謝，而MSCs 向成骨細胞分化過程主要依靠線粒體氧化磷酸化獲能[57,58]。3-磷酸甘油酸[36,52]、丙酮酸和乳酸[52]水平降低，可能表明ONFH 的能源供應(yīng)受到干擾。3-磷酸甘油酸和丙酮酸水平降低，說明了丙酮酸來到線粒體后經(jīng)過氧化脫羧后產(chǎn)生的乙酰CoA 減少，導(dǎo)致進一步通過TCA 循環(huán)時所生成的能量減少。而乳酸以及丙酮酸等還是糖異生過程中的原材料，他們可以通過這個過程轉(zhuǎn)化為葡萄糖再進行糖酵解。這些都說明了ONFH 患者糖酵解和TCA 循環(huán)兩個能量代謝途徑受到了顯著干擾。

代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示了ONFH 患者的多個代謝途徑受到了明顯的干擾，主要有核苷酸、嘌呤、氨基酸、脂質(zhì)、能量代謝等多個途徑。但是目前對代謝途徑的研究還處于初步階段，還需要進一步加大對ONFH 患者的代謝途徑變化的研究，從而探索ONFH 的發(fā)病機制，并積極尋找治療ONFH 的新靶點。

四、總結(jié)和展望

代謝組學(xué)是一種新興的組學(xué)方法，它不僅彌補了其他組學(xué)在研究中的不足，還在過去的幾十年里，在各個領(lǐng)域取得了巨大的進展。由于分析技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷進步與發(fā)展，代謝組學(xué)被廣泛作為醫(yī)學(xué)研究中的新興診斷、探索疾病發(fā)病機制、評估預(yù)后情況以及治療新靶點的工具。但是由于代謝組學(xué)的起步較晚，從整體水平上看，代謝組學(xué)現(xiàn)在還處在成長的初步階段。由于樣品的復(fù)雜、儀器的繁瑣、沒有統(tǒng)一標準化的數(shù)據(jù)庫等使代謝組學(xué)面臨著重大的困難和挑戰(zhàn)。ONFH 是骨科的常見病、多發(fā)病和難治性疾病，其病因以及發(fā)生機制尚未完全明確，如不早期診斷和治療，病人將走向髖關(guān)節(jié)置換這一步，這嚴重降低了患者及其家人的生活質(zhì)量水平。目前，代謝組學(xué)在股骨頭壞死領(lǐng)域取得了一定的研究進展，特別是在股骨頭壞死的診斷性生物標志物及代謝途徑等方面，這讓我們看到了代謝組學(xué)在ONFH 領(lǐng)域具有重大的前途。但是，就目前研究情況來看，相關(guān)研究報道所涉及的生物標志物不同或生物標志物變化趨勢與疾病的發(fā)生關(guān)系相反等，這可能與研究對象分期、代償或失代償、檢測樣本與技術(shù)、數(shù)據(jù)庫等具有差異有關(guān)，這也是研究股骨頭壞死面臨的挑戰(zhàn)。相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)對疾病的探索會有更深一步的發(fā)展，從而科學(xué)合理地保障人們的生命健康安全。