水稻短胚芽鞘基因SCP1的圖位克隆

王芳芳, 李宇翔, 梁宇航, 黃榮峰, 張玉瓊, 秦華*

(1.安徽農業(yè)大學生命科學學院, 合肥 230036; 2.中國農業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081)

水稻是重要的糧食作物，作為半水生作物，其需要長期對抗低氧環(huán)境。水稻黃化苗的胚芽鞘能夠在低氧、無光環(huán)境下保護真葉，胚芽鞘通過伸長使真葉盡快接觸到氧氣和光，對于水稻幼苗的形態(tài)建成尤其重要[1]。胚芽鞘伸長受到諸多因素影響，植物激素在此過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。

水稻G蛋白α亞基(OsRGA1)參與激素信號轉導及生長發(fā)育和耐逆性調控。osrga1突變體表現出植株矮化、小粒、穗直立、耐鹽、耐旱等表型[4-5]。近些年通過正向遺傳學等方法已克隆了8個OsRGA1等位突變體，其中d1突變體耐旱性比野生型顯著增強，在連續(xù)干旱14 d的條件下，d1突變體葉片依然呈現深綠的狀態(tài)，而野生型葉片早已萎蔫發(fā)黃[4]。sd58是OsRGA1的另一個等位突變體，與野生型相比，sd58突變體耐鹽性更強，進一步研究表明，OsRGA1通過調控鹽脅迫條件下水稻體內活性氧的積累來提高水稻的耐鹽性[5]。油菜素內酯處理d1突變體，發(fā)現其葉夾角和胚芽鞘對油菜素內酯敏感性降低，說明OsRGA1可能參與油菜素類固醇信號的轉導[6]。除此之外，OsRGA1位于赤霉素信號轉導關鍵組分SLR1的下游，參與GA 信號的轉導[7]。在水稻中敲除OsRGA1將抑制乙烯誘導的表皮細胞死亡[8-9]，說明OsRGA1參與乙烯信號的傳遞。

乙烯作為一種重要的植物激素，在植株的生長發(fā)育及應對外界環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[10],植物內源乙烯含量主要取決于乙烯合成。乙烯的合成是以甲硫氨酸(Met)作為前體在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase, SAMS)的催化作用下生成SAM，SAM進一步由1-氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS) 催化生成 5′-甲硫基核糖(5′-methylthiribose，MTR)和1-氨基環(huán)丙烷羧酸(1-amino-cyclopropanecarboxylic acid，ACC)，ACC在ACC氧化酶(ACO)作用下生成乙烯[11]，該步驟是整個乙烯合成過程的限速步驟[12]。已有研究表明，對乙烯合成基因的調控主要集中在轉錄水平和轉錄后水平，水淹可以誘導OsACS1、OsACS5和OsACO1基因的表達，從而促進胚芽鞘生長和節(jié)間伸長來使機體免受損害[13-14]；OsEOL1和OsEOL2都編碼E3連接酶，均可與OsACS5相互作用，促進其泛素化并加速其降解，從而降低體內乙烯含量[15]。乙烯合成后，會通過相應的乙烯信號轉導途徑進行傳遞，調控下游乙烯響應基因，從而調節(jié)植株生長發(fā)育和應對外界生物和非生物脅迫[16]。水稻中乙烯能夠抑制黃化苗根生長和促進胚芽鞘伸長，即典型的“二重反應”[17]。目前利用此“二重反應”，對水稻黃化苗外源施加乙烯，已經篩選和鑒定出很多乙烯響應缺陷突變體，如mhz2[18]、mhz3[19]、GY1[20]、mhz4[21]、mhz5[22]、mhz6[3]、mhz7[2]等。但是對本身具有組成型乙烯表型即與內源乙烯合成相關的突變體克隆較少。

雖然關于OsRGA1已有很多報道，但是該基因是否參與調控乙烯的合成還并不清楚。本研究利用水稻的乙烯“二重反應”從本課題組構建的水稻突變體庫中篩選到一個短胚芽鞘突變體(shortcoleoptile1，scp1)，其乙烯合成基因表達水平及乙烯釋放量均低于野生型，并且表現出較強的耐鹽和耐旱性。通過圖位克隆將突變基因定位在5號染色體上32.01 kb的區(qū)間內，擴增與測序發(fā)現該區(qū)間內OsRGA1基因存在大片段缺失，從而導致該基因功能缺失。本研究結果為探究OsRGA1調控水稻乙烯合成，解析影響胚芽鞘的生長及耐逆性的分子機理奠定了基礎，有助于豐富水稻體內乙烯合成的調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試材料 野生型華占(Huazhan，HZ)與中花11(Zhonghua11，ZH11)水稻種子由本課題組保存，并創(chuàng)建3 000份以HZ為背景且用鈷誘變后的水稻突變體庫，篩選獲得scp1突變體，創(chuàng)建用于克隆SCP1基因的F2群體。d1突變體由中國科學院植物研究所種康研究員惠贈，并由本實驗保存和繁殖。

1.1.2種植條件 用于農藝性狀調查及基因定位的群體均在河北廊坊試驗基地種植。用于鹽及干旱處理的幼苗種植于小方盒中土培，放在28 ℃溫室中(16 h光/8 h 暗)，生長14 d后分成三組，對照組正常條件下生長，鹽處理組加入適量150 mmol·L-1NaCl溶液生長7 d，干旱處理組保持干旱狀態(tài)生長7 d。用于觀察胚芽鞘表型的幼苗種植于放在水中的鐵絲網架上，保持水面剛好接觸到種子，放入28 ℃避光生長3～5 d左右。

1.1.3試驗試劑 用于提取RNA的Trizol試劑盒購自康為世紀生物技術有限公司； 用于反轉錄的試劑盒購自南京諾唯贊有限公司；用于熒光定量 PCR的SYBR Green Mix購自依聯(lián)軒生物科技有限公司，用于普通PCR的Mix購于擎科生物技術有限公司。

1.1.4主要儀器及設備 用于培養(yǎng)水稻幼苗的GP-01光照培養(yǎng)箱購自湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；用于測定乙烯含量的GC-2014氣相色譜儀購自日本島津公司； Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀購自于美國伯樂公司；用于擴增DNA序列的ETC-811 PCR儀購自于北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 突變體篩選

將輻射誘變的每一份突變體材料各取出30粒種子，37 ℃浸種24 h，選取萌動一致的種子種在不銹鋼網架上，放入塑料盒中，加水至液面剛接觸到種子，置于黑暗條件下，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，篩選出胚芽鞘較野生型過長或過短的突變體，用于后續(xù)研究。

1.3 乙烯的測定

在150 mL的透明玻璃小瓶中倒入50 mL 1/2 MS固體培養(yǎng)基[23]，待培養(yǎng)基冷卻后將已萌動的水稻種子均勻種在瓶子里，光照培養(yǎng)箱(28 ℃，光照16 h/黑暗8 h )生長3 d后用封口膜將瓶口密封，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，從每個小瓶中抽取1 mL氣體，用氣相色譜儀測定瓶內乙烯含量[24]。

1.4 表型分析及農藝性狀統(tǒng)計

將scp1突變體材料和野生型HZ浸水后放在37 ℃培養(yǎng)箱中，待萌動后，挑取萌動一致的種子種在不銹鋼網架上，暗培養(yǎng)3 d，觀察并統(tǒng)計胚芽鞘長度。選取土培14 d左右的幼苗進行拍照并統(tǒng)計株高；成苗株高、節(jié)間長與分蘗數等農藝性狀在大田中選取成熟期植株進行拍照和統(tǒng)計；在種子成熟后對其稱重，并拍照統(tǒng)計粒形與千粒重；重復3次。

1.5 實時熒光定量PCR

取暗下培養(yǎng)3 d幼苗的胚芽鞘，提取總RNA，反轉錄成cDNA作為實時熒光定量PCR的模板，檢測目的基因的表達。PCR反應體系：cDNA模板1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，正反向引物各0.3 μL(表1)，雙蒸水8.4 μL。反應程序： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)；以每30 s上升0.5 ℃的速率從55 ℃升至95 ℃來作為溶解曲線程序。

1.6 耐鹽性和耐旱性實驗

將在溫室生長14 d的HZ和scp1幼苗分成三組，對照組澆自來水，鹽處理組澆含有150 mmol·L-1NaCl的水溶液，干旱處理組不澆水保持干旱狀態(tài)，每日觀察葉片萎蔫和黃化情況，當同組內材料之間存在顯著差異時拍照并復水，復水培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計成活率，重復3次。

1.7 基因定位

在實驗田中將scp1和ZH11雜交獲得F1，加繁一代得到F2群體，篩選F2群體中具有短胚芽鞘表型的單株，用CTAB法提取基因組DNA后，隨機選取20份所提取的DNA等濃度混勻作為DNA混池。分別以混池DNA及HZ和ZH11的DNA作為模板，利用本實驗室已鑒定的覆蓋水稻全基因組的SSR和Indel標記作為引物(表1)進行RCR擴增。擴增體系：DNA模板1 μL，2× PCR Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，雙蒸水8 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共32個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產物用濃度為4% (質量體積份數) 的瓊脂糖凝膠進行電泳。通過統(tǒng)計交換率確定SCP1基因所在的染色體及區(qū)間。通過國家水稻數據庫RAP-DB(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)查找該區(qū)域存在的功能基因，用NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設計引物擴增候選基因并測序，確定突變基因。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in the study

2 結果與分析

2.1 SCP1調控胚芽鞘的生長及乙烯合成

從圖1可以看出，scp1突變體胚芽鞘長度只有對照的57%左右。已有研究表明，乙烯促進胚芽鞘的伸長[17]。為了探究scp1短胚芽鞘的表型是否是由于乙烯合成減少所致，測定scp1與HZ的乙烯釋放量，發(fā)現scp1乙烯釋放量明顯低于HZ，進一步利用qPCR檢測scp1和HZ胚芽鞘中乙烯合成基因的表達，發(fā)現在scp1突變體中乙烯合成基因ACO5、ACO6、ACS2、ACS5、ACS6表達水平均明顯降低。以上結果說明，scp1突變體的短胚芽鞘表型是由于體內乙烯合成量減少導致的。

2.2 scp1突變體農藝性狀分析

從表2和圖2可以看出，scp1突變體除了短胚芽鞘的表型之外，在幼苗期和成熟期株高也顯著低于野生型，其中幼苗期scp1突變體株高只有HZ的一半。測量成熟期植株的節(jié)間長度發(fā)現，scp1突變體各節(jié)間長度均短于HZ，第三節(jié)間和第五節(jié)間最為顯著。scp1突變體的粒長只有HZ的51%左右，但粒寬沒有明顯差異，千粒重明顯低于HZ。這些結果表明，SCP1影響株高、粒形和產量。

圖2 scp1突變體的農藝性狀Fig.2 Agronomic traits analysis of scp1 mutants

表2 scp1突變體農藝性狀Table 2 Agronomic traits of scp1 mutants

2.3 SCP1參與鹽和干旱脅迫應答

鹽和干旱是兩種常見的非生物脅迫，嚴重影響水稻產量，因此，提高水稻耐鹽性和耐旱性具有重要的意義。乙烯作為重要的植物激素，在調控植物耐鹽性[3]和耐旱性[25]中發(fā)揮重要作用。SCP1影響乙烯合成，表明SCP1可能參與調控水稻的耐鹽性和耐旱性。對土培14 d的幼苗進行鹽處理和干旱處理，結果(圖3)發(fā)現，兩個處理組內scp1突變體的萎蔫率明顯低于HZ，且HZ的葉色發(fā)黃而scp1突變體葉片仍舊保持綠色且舒展。復水后scp1突變體成活率顯著高于HZ。以上結果表明，SCP1負調控水稻的耐鹽性和耐旱性，而這種調控作用可能是由于scp1突變體體內乙烯合成降低導致的。

2.4 scp1突變體功能基因的圖位克隆

在scp1與ZH11雜交后代的F2群體中篩選具有短胚芽鞘表型的單株，統(tǒng)計分離比，短胚芽鞘與正常胚芽鞘的比例近1∶3，說明該突變表型是單基因控制的隱性遺傳。提取具有短胚芽鞘表型單株的DNA，利用圖位克隆技術將SCP1基因定位在5號染色體上兩個分子標記(M1560與M1564)之間，該區(qū)間范圍32.01 kb。在水稻數據庫(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)中查詢，發(fā)現此區(qū)間內存在5個功能基因(圖4)，其中3個編碼未知蛋白(LOC_ Os05g26860、LOC_Os05g26870、 LOC_Os05g26880)，1個編碼Dna J伴隨蛋白(LOC_Os05g 26902)，還有1個已克隆的基因OsRGA1(LOC_Os05g26890)，編碼GTP結合蛋白。在scp1突變體和HZ中對這五個功能基因進行擴增和測序，發(fā)現scp1突變體中OsRGA1基因組序列開放閱讀框第1 110 bp后完全缺失，通過qPCR檢測，發(fā)現scp1突變體中OsRGA1基因完全不表達，從而導致功能完全喪失。而其他四個基因序列沒有突變且表達水平也沒有改變，表明scp1突變體的表型是由于OsRGA1基因突變所致。

注：*和**分別代表與HZ相比在 P<0.05和 P<0.01水平具有統(tǒng)計學意義。Note: * and ** indicate statically significant difference compared to HZ at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖1 SCP1調控胚芽鞘的生長及乙烯合成Fig.1 SCP1 regulates coleoptile growth and ethylene biosynthesis

注：*代表與HZ相比在 P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: * indicates statically significant difference compared to HZ at P<0.05 level.圖3 HZ與scp1突變體鹽和干旱脅迫表型和成活率Fig.3 Phenotype and survival rate of HZ and scp1 mutants under salt and drought stress

為了進一步驗證該突變體是由OsRGA1基因突變引起的，對osrga1的另一個等位突變體d1進行觀察，發(fā)現d1也表現出短胚芽鞘的表型，乙烯釋放量測定結果表明，d1乙烯釋放量顯著低于野生型，與scp1突變體類似(圖5)。以上結果表明，scp1突變體是osrga1的另一個等位突變體。

3 討論

OsRGA1基因早已被克隆出來[26]，到目前已陸續(xù)報道了至少8個點突變體或者片段插入突變體，例如等位突變體d1、dwarf89[27]及cha-2[28]中OsRGA1基因表達水平顯著降低，且均表現出矮桿、粒小且圓等性狀特征。本研究篩選到一個短胚芽鞘突變體，通過圖位克隆發(fā)現OsRGA1基因組序列存在大片段缺失，導致scp1體內OsRGA1基因不表達(圖4)。scp1表現出與osrga1突變體類似的株高、粒形等表型，說明scp1是osrga1的等位突變體。胚芽鞘在水稻破殼、出土[29]及逆境脅迫[30-31]應答過程中起著重要作用。本研究發(fā)現OsRGA1通過調控水稻乙烯生物合成來調控胚芽鞘的生長及苗期耐逆性，進一步豐富了OsRGA1在水稻中的功能，同時也為OsRGA1功能研究提供材料。

圖4 SCP1基因的圖位克隆Fig.4 Map-based cloning of the SCP1 gene

注：*代表與HZ相比在 P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: * indicates statically significant difference compared to HZ at P<0.05 level.圖5 d1胚芽鞘表型和乙烯釋放量Fig.5 Coleoptile phenotype and ethylene production in d1 coleoptile

乙烯是一種重要的植物激素，從植物種子萌發(fā)到器官衰老的過程中都有重要作用，而且在植物應對生物和非生物脅迫中起著關鍵作用[10]。目前已有研究表明，OsRGA1參與赤霉素信號轉導途徑來調控節(jié)間伸長[32]，并且在乙烯介導的缺氧信號傳遞過程中起調節(jié)作用[9]，表明OsRGA1參與多種激素信號的轉導過程。但是OsRGA1與乙烯合成之間的關系還不清楚。本研究結果顯示，scp1突變體中乙烯合成基因的表達水平明顯低于野生型，并且其乙烯釋放量也顯著低于野生型(圖1)，說明OsRGA1參與調控水稻乙烯的合成。該研究豐富了該基因在激素合成與信號傳遞過程中的角色，但是目前還未研究清楚該基因具體如何調控乙烯合成的，這將是下一步工作的重點。

鹽和干旱是水稻可能面臨的兩大非生物脅迫[33]。從本研究可以看出，scp1突變體表現出更強的耐鹽性和耐旱性(圖3)，這與已報到的d1突變體類似[4, 34]。同時scp1突變體中乙烯含量降低，表明SCP1可能通過調控乙烯合成來影響水稻的耐旱和耐鹽性。但具體機制還有待深入研究。

綜上所述，本研究克隆了一個與乙烯合成相關的突變體，表現出短胚芽鞘的表型。通過圖位克隆確定該表型是由于基因LOC_Os05g26890(OsRGA1)突變所致。scp1突變體表現出矮化、小粒、耐鹽性和耐旱性增強，說明該基因可能為育種專家權衡產量與耐逆性提供材料。同時scp1突變體的乙烯合成量減少，說明其可能參與了乙烯的合成調控途徑，拓展了OsRGA1的功能。