5-甲酰四氫葉酸促進(jìn)水稻幼苗在低氮條件下生長(zhǎng)發(fā)育的研究

易塵， 張春義， 梁秋菊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081)

葉酸(維生素B9)屬于水溶性B族維生素，是包含四氫葉酸(tetrahydrate，THF)及其衍生物在內(nèi)的總稱。葉酸分子包含三部分：蝶呤環(huán)(2-氨基-4-羥基-6-甲基蝶啶)、對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoate，pABA)和谷氨酸(1～7個(gè))[11]。葉酸作為一碳反應(yīng)的重要輔因子，在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)參與一碳單位的轉(zhuǎn)移。不同氧化程度的一碳(one carbon，C1)單位(包括甲基、亞甲基、次甲基、甲酰基，從還原態(tài)到氧化態(tài))連接在蝶呤環(huán)的N5位或?qū)Π被郊姿岬腘10位，也可橋連在兩者之間，構(gòu)成不同形式的葉酸衍生物。葉酸衍生物通過(guò)介導(dǎo)一碳代謝參與了機(jī)體內(nèi)的多種代謝過(guò)程，包括嘌呤、胸苷酸、甲硫氨酸、絲氨酸、甘氨酸和泛酸的生物合成及甲基化修飾過(guò)程[12-13]。植物中，葉酸被報(bào)道參與光呼吸過(guò)程、木質(zhì)素和葉綠素合成及氮代謝過(guò)程[14]。

擬南芥葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)功能缺失突變體的氮代謝出現(xiàn)異常。擬南芥基因組編碼三個(gè)葉酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase，F(xiàn)PGS)，包括質(zhì)體定位的FPGS1(AtDFB)、線粒體定位的FPGS2(AtDFC)和胞質(zhì)定位的FPGS3(AtDFD)，負(fù)責(zé)葉酸的聚谷氨酰化[15]。FPGS2功能缺失突變體幼苗在低氮條件下生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，其光呼吸及氮代謝發(fā)生異常[16]。相比于野生型，F(xiàn)PGS1功能缺失突變體dfb的種子中氮含量增加，蔗糖和有機(jī)酸含量也增加，而游離氨基酸如Asn、Glu及硝酸根含量明顯降低；暗培養(yǎng)條件下dfb突變體對(duì)低氮脅迫更加敏感，突變體的葉酸和氮代謝物含量都發(fā)生明顯改變[17]。這些研究表明，植物體內(nèi)葉酸代謝與氮代謝密切相關(guān)。

為進(jìn)一步探索葉酸代謝與植物氮代謝的作用關(guān)系，本研究利用水培的方式在不同氮濃度下培養(yǎng)水稻幼苗，并在培養(yǎng)液中施加5-甲酰四氫葉酸(5-formyltetrahydrofolate, 5-F-THF)分析葉酸在水稻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，著重關(guān)注在低氮條件下葉酸對(duì)水稻幼苗氮代謝的影響，從而為解析葉酸參與植物氮代謝的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為作物生產(chǎn)中緩解低氮脅迫、提高植物氮利用效率提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1水稻材料 野生型水稻日本晴(OryzasativaL.，Japonica)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑 葉酸衍生物5-甲基四氫葉酸、5-甲酰四氫葉酸、四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸購(gòu)自瑞典Schircks Lab；4-羥乙基哌嗪乙磺酸、Triton X-100、牛血清白蛋白、水楊酸、咪唑、N-1-萘乙二胺、磺胺、苯甲基磺酰氟、聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸鋰、亮肽素、甲基紫精、谷氨酸鈉等試劑購(gòu)自Sigma；Bradford工作液購(gòu)自Bio-Rad；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentals；RNA提取試劑盒購(gòu)自原平皓公司；Real-time 試劑購(gòu)自TaRaKa；引物由華大基因合成。

1.2 培養(yǎng)方法

5-甲酰四氫葉酸粉末用滅菌水配置成10 mmol·L-1母液，-80 ℃存儲(chǔ)備用。水稻種子放于水潤(rùn)濕的濾紙上，37 ℃培養(yǎng)2 d；待種子萌發(fā)，挑選發(fā)芽一致的水稻幼苗移到濕潤(rùn)的蛭石中，轉(zhuǎn)到人工氣候室中培養(yǎng)7 d(期間蛭石中只澆水)，溫室溫度設(shè)置為30 ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度為12 000 lx；之后使用含有5-甲酰四氫葉酸(終濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置為0、10、50、200、500 μmol·L-1)的1/2 Yoshida營(yíng)養(yǎng)液[18](除NH4NO3濃度外，其他成分濃度均為標(biāo)準(zhǔn)濃度的一半)進(jìn)行第一次澆灌，溫室繼續(xù)培養(yǎng)6 d；使用含有5-F-THF(濃度同第一次時(shí))的標(biāo)準(zhǔn)Yoshida營(yíng)養(yǎng)液[18]進(jìn)行第二次澆灌，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)9 d后收獲幼苗，觀察表型并檢測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo)，對(duì)照組材料培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)液中不添加5-F-THF。為進(jìn)一步分析施加外源5-F-THF對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響及作用機(jī)制，選用了營(yíng)養(yǎng)液中NH4NO3提供氮濃度為0.01 mmol·L-1時(shí)分別添加濃度為0、50、200 μmol·L-1的5-F-THF和NH4NO3提供氮濃度為2 mmol ·L-1(不添加5-F-THF)四種培養(yǎng)條件，即0.01 N、0.01 N + 50 μmol·L-15-F-THF、0.01 N + 200 μmol·L-15-F-THF、2 N進(jìn)行水稻培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)Yoshida營(yíng)養(yǎng)液中NH4NO3濃度為1.45 mmol·L-1(即2.9 N)。設(shè)計(jì)了0.01、0.1、0.3、0.5、1、2、2.9和5.8 N的營(yíng)養(yǎng)液，在配置中僅調(diào)整了Yoshida營(yíng)養(yǎng)液中NH4NO3的濃度，對(duì)應(yīng)的NH4NO3終濃度分別設(shè)置為0.005、0.05、0.15、0.25、0.5、1、1.45 和2.9 mmol·L-1，其他成分不變。

1.3 生理指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1葉綠素檢測(cè) 收集100 mg水稻幼苗地上部分，用95%乙醇浸泡2～5 min脫水后，液氮研磨，然后將粉末轉(zhuǎn)移至1 mL 80%的丙酮中，混勻，黑暗下放置30 min；4 ℃ 3 000 r·min-1離心15 min，上清液利用紫外分光光度計(jì)(UV1901PC，上海奧析)檢測(cè)OD663和OD645的吸光值，以80%丙酮作為空白對(duì)照，計(jì)算葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)及Chla+Chlb含意。

Chla (mg·g-1)=[12.72×OD663-2.59×OD645] ×V/1 000×W

Chlb (mg·g-1)=[22.88×OD645-4.67×OD663] ×V/1 000×W

Chla+Chlb (mg·g-1)=[8.05×OD663+20.29×OD645] ×V/1 000×W

式中，V為上清液體積，mL；W為葉片質(zhì)量，g。

1.3.2可溶性蛋白檢測(cè) 可溶性蛋白提取液配置：取2.38 g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶于100 mL水中，使用 KOH調(diào)節(jié) pH至7.5，使用前加體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100。

牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)定：10 mL離心管中分別加入BSA標(biāo)準(zhǔn)液(濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1)各100 μL，之后加入至5 mL Bradford工作液中，混勻，靜置5 min后測(cè)定OD595的吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取30 mg水稻樣品液氮研磨，粉末迅速加入0.5 mL蛋白提取液，冰上震蕩20 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清100 μL，加入5 mL Bradford進(jìn)行顯色，5 min后測(cè)定OD595。根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

新鮮樣品30 mg加入提取液在冰上研磨，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，將0.2 mL上清轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，先加入2.5 mL顯色劑1充分混勻，再加入2.5 mL顯色劑2充分混勻，37 ℃下保溫20 min，測(cè)定OD550，對(duì)照組使用0.2 mL去離子水代替0.2 mL上清液。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)濃度為50～250 μmol·L-1的NH4Cl溶液繪制[20]。

1.3.5游離氨基酸含量的檢測(cè) 稱量300 mg幼苗，液氮充分研磨成粉末，加入 1 mL 提取緩沖液(80%乙醇)，充分混合后10 000 r·min-1離心10 min。將500 μL上清置于低溫真空干燥儀(Alpha1-2 LDplus，Christ)中進(jìn)行干燥，將得到的殘基溶解于0.2 mol·L-1的檸檬酸鋰溶液中(pH 2.2)。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所利用HPLC法測(cè)定游離氨基酸含量。

1.3.8谷氨酰胺合成酶活性檢測(cè) 30 mg樣品液氮研磨成粉，加入1 mL提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.6，1 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1β-巰基乙醇)，充分混勻后 4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min，向200 μL上清中加入500 μL反應(yīng)液(75 mmol·L-1咪唑，60 mmol·L-1谷氨酸鈉，50 mmol·L-1MgSO4，6 mmol·L-1NH2OH，60 mmol·L-1ATP)和300 μL水， 30 ℃下孵育15 min，加入200 μL酸性FeCl3溶液(88 mmol·L-1FeCl3，670 mmol·L-1HCl， 200 mmol·L-1TCA)終止反應(yīng)，顯色10 min，室溫下4 000 r·min-1離心10 min，上清測(cè)定OD540吸光值。GS酶活性用每毫克樣品每分鐘形成的γ-谷氨酰羥肟酸(nmol)表示[16]。

1.3.9谷氨酸合酶活性檢測(cè) 30 mg樣品液氮研磨成粉，加入1 mL提取液 (100 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液，1.28 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1β-巰基乙醇)，充分混勻后 4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min，向200 μL上清中加入500 μL反應(yīng)液(200 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液，20 mmol·L-1Gln，20 mmol·L-1β-酮戊二酸，0.1 mmol·L-1NADH)和200 μL水，30 ℃孵育5 min，加入100 μL 10 mmol·L-1的Na2S2O4(溶解于40 mmol·L-1NaHCO3溶液)，30 ℃反應(yīng)15 min，將溫度加熱到98 ℃持續(xù)5 min，終止反應(yīng)。取200 μL反應(yīng)混合物，加入400 μL顯色液(80 mg茚三酮溶于4 mL無(wú)水乙醇，加入12 μL冰醋酸)，400 μL磷酸鉀緩沖液(pH 8.04)和1 mL水，100 ℃水浴15 min，冷卻至室溫后加水稀釋至10 mL，測(cè)定OD570。GOGAT酶活性用每毫克樣品每分鐘形成的谷氨酸(nmol)表示[23]。

1.3.10葉酸的提取和檢測(cè) 葉酸提取液：50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、1%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))抗壞血酸鈉、0.2%(體積分?jǐn)?shù))β-巰基乙醇，新鮮配置。

水稻葉片液氮研磨后，稱取50 mg粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL螺旋帽管中，加入1 mL葉酸提取液，震蕩混勻后沸水煮10 min，冰上立即冷卻10 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min，取500 μL上清于新的螺帽管中，每管加入35 μL大鼠血清，37 ℃孵育4 h。再次沸水煮10 min，冰上冷卻10 min，4 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min。取450 μL上清加入3 kD超濾管(UFC5003BK，Millipore)中，4 ℃ 13 000 r·min-1離心20 min，取90 μL超濾后的葉酸溶液加入10 μL MTX(0.2 μg·mL-1，作為內(nèi)標(biāo))，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所公共實(shí)驗(yàn)室利用LC-MS/MS(Agilent 1260-6400 QQQ)檢測(cè)葉酸含量。

1.3.11Real-time PCR檢測(cè) 使用RNA提取試劑盒提取水稻葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，利用ABI7500 儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系參照SYBR使用說(shuō)明，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Primers for real time PCR

1.3.12數(shù)據(jù)分析 每個(gè)生理指標(biāo)的檢測(cè)進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果用三次重復(fù)的平均值表示，利用t-test進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮濃度條件下水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育

從圖1可以看出，在0.01～2 N條件下，隨著營(yíng)養(yǎng)液中氮濃度的增加水稻幼苗地上部分的長(zhǎng)勢(shì)越好，幼苗地上部長(zhǎng)度和鮮重逐漸增加，并在2 N條件下達(dá)到最高，然而在2.9和5.8 N條件中水稻幼苗的生長(zhǎng)沒(méi)有進(jìn)一步提高，幼苗地上部高度和鮮重逐漸降低。在0.01、0.1、0.3、0.5 N條件下觀察到水稻幼苗葉片發(fā)黃，進(jìn)一步進(jìn)行葉綠素含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著營(yíng)養(yǎng)液中氮濃度升高幼苗葉綠素含量逐漸增加。這些結(jié)果表明，水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育依賴于培養(yǎng)條件中硝酸根的存在，氮素在2和2.9 N左右時(shí)更有利于水稻幼苗的生長(zhǎng)，過(guò)高的NH4NO3濃度(如5.8 N)反而不利于水稻幼苗的生長(zhǎng)。

圖1 不同氮濃度下水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育Fig.1 Rice seedlings growth in different nitrigon concentration

2.2 施加葉酸對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

從圖2可以看出，在低氮條件(0.01 N)下，施加外源5-F-THF能夠促進(jìn)水稻幼苗的生長(zhǎng)，幼苗葉片生長(zhǎng)較快。低氮條件下，水稻地上部分的長(zhǎng)度、鮮重和第二片葉的葉綠素含量均隨著施加5-F-THF濃度的增加而增加，并在外源施加5-F-THF濃度為 200 μmol·L-1時(shí)達(dá)到最高，在5-F-THF濃度為 500 μmol·L-1又降低。在2 N條件下，當(dāng)施加10、50 μmol·L-15-F-THF時(shí)水稻地上部的長(zhǎng)度、鮮重隨著葉酸濃度增加而增加，隨著5-F-THF 濃度提高到200、500 μmol·L-1時(shí)又降低。這些結(jié)果表明，無(wú)論在氮缺乏或氮充分條件下一定濃度5-F-THF的施加會(huì)促進(jìn)水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。尤其當(dāng)培養(yǎng)液中氮素濃度較低時(shí)，外源5-F-THF的施加能夠緩解水稻幼苗的低氮脅迫現(xiàn)象。

圖2 施加不同濃度5-甲酰四氫葉酸時(shí)水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育Fig.2 Rice seedlings growth in different folate concentration

2.3 水稻幼苗中葉酸含量的分析

從圖3可以看出，在0.01 N條件下，添加50和200 μmol·L-1的5-F-THF，水稻幼苗的葉酸衍生物包括5-F-THF、5，10-次甲四氫葉酸(5,10-CH=THF)、5-甲基四氫葉酸(5-M-THF)、四氫葉酸(THF)含量顯著高于未添加時(shí)，5-F-THF含量分別為未添加的2.31和5.11倍，5,10-CH=THF含量分別為未添加的4.32和8.42倍，5-M-THF含量分別為未添加的1.28和8.42倍，THF含量分別為未添加的1.59和4.99倍。這表明外源添加的5-F-THF能夠被水稻根部吸收，并向葉片運(yùn)輸，同時(shí)吸收進(jìn)入細(xì)胞的5-F-THF會(huì)轉(zhuǎn)換生成其他形式的葉酸。

在2 N條件下幼苗體內(nèi)的5-F-THF和5,10-CH=THF含量顯著低于0.01 N條件，為0.01 N條件時(shí)含量的75%和74%，5-M-THF和THF含量在兩種條件中沒(méi)有顯著差異。

注：*和**分別表示與0.01 N處理相比差異在P<0.05和P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note：* and ** indicate significant difference compared with 0.01 N treatment at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖3 外源添加5-F-THF對(duì)水稻幼苗葉酸含量的影響Fig.3 Effects of 5-F-THF on the content of folate in rice seedlings

2.4 水稻幼苗氮代謝相關(guān)生理指標(biāo)的分析

注：*和**分別表示與0.01 N處理相比差異在P<0.05和P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note：* and ** indicate significant difference compared with 0.01 N treatment at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖4 外源添加5-F-THF對(duì)水稻幼苗可溶性蛋白和游離氨基酸含量的影響Fig.4 Effects of treatment with 5-F-THF on soluble protein and free amino acid in rice seedlings

2.5 水稻幼苗氮代謝關(guān)鍵酶活性的分析

進(jìn)一步對(duì)參與擬南芥氮代謝的關(guān)鍵酶包括硝酸根還原酶(NR)、亞硝酸根還原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)酶活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， NiR活性在2 N條件下顯著低于0.01 N條件下，且在0.01 N條件添加200 μmol·L-15-F-THF時(shí)，NiR活性顯著降低；GS活性2 N條件下顯著高于0.01 N條件，在0.01 N條件外源5-F-THF的添加前后GS活性沒(méi)有顯著變化；0.01 N條件隨著外源5-F-THF的添加GOGAT顯著增加；NR活性在四種培養(yǎng)條件中沒(méi)有明顯差異(圖5)。這些結(jié)果表明，外源5-F-THF四氫葉酸添加后，水稻幼苗體內(nèi)可溶性蛋白的積累增多，幼苗體內(nèi)GOGAT活性升高，NiR活性降低。

注：** 表示與0.01 N處理相比差異在P<0.01水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note：** indicates significant difference compared with 0.01 N treatment at P<0.01 level.圖5 外源添加5-F-THF對(duì)水稻幼苗NR、NiR、GS、GOGAT酶活的影響Fig.5 Effects of 5-F-THF on enzymatic activity of NR, NiR, GS, GOGAT in rice seedlings

注：*和**分別表示與0.01 N處理相比差異在P<0.05和P<0.01水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note：* and ** indicate significant difference compared with 0.01 N treatment at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively.圖6 外源添加5-F-THF對(duì)水稻幼苗NR、NiR、GS、GOGAT基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Effects of treatment with 5-F-THF on transcriptional expression of NR, NiR, GS, GOGAT in rice seedlings

2.6 水稻幼苗氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)

四種培養(yǎng)條件中水稻幼苗氮代謝相關(guān)基因包括硝酸根還原酶(NR)、亞硝酸根還原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)的表達(dá)水平如圖6所示。2 N條件培養(yǎng)時(shí)幼苗體內(nèi)的NR1、NiR1、NiR2、GS1.2、GS1.3、GS2、NADH依賴的GOGAT1(NADH-GOGAT1、NADH-GOGAT2)和Fd依賴的GOGAT1(Fd-GOGAT1)基因的轉(zhuǎn)錄顯著高于0.01 N條件，分別為0.01 N條件的3、11、61、2.13、5.37、3.32、6.4、15.57和4.92倍。0.01 N條件添加50 μmol·L-15-F-THF時(shí)水稻幼苗的GS1.1、NADH-GOGAT1、NADH-GOGAT2和Fd-GOGAT1基因的轉(zhuǎn)錄顯著增高，為不添加時(shí)的1.73、1.74、1.98和2.03倍；NR1、NR2、GS1.2基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，為不添加時(shí)的37%、32%、36%。0.01 N條件添加200 μmol·L-15-F-THF時(shí)水稻幼苗的GS1.3、NADH-GOGAT1、NADH-GOGAT2基因的表達(dá)水平顯著高于0.01 N不添加5-F-THF時(shí)，為不添加時(shí)的11.32、7.3、17.45倍；NR1、GS1.2轉(zhuǎn)錄顯著低于未添加時(shí)的15%、48%(圖6)。這些結(jié)果表明，外源5-F-THF的施加后水稻幼苗的NADH-GOGAT1、NADH-GOGAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，這與外源5-F-THF添加后水稻幼苗GOGAT活性增加較為一致。

3 討論

植物氮代謝包括氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、還原和同化、再利用、氨基酸合成和代謝、碳氮代謝互作等過(guò)程[24-25]。植物氮代謝過(guò)程較為復(fù)雜，每個(gè)環(huán)節(jié)都可能受到遺傳和環(huán)境因素的影響。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，研究者對(duì)植物氮代謝過(guò)程有了基本認(rèn)識(shí)，但對(duì)植物氮代謝調(diào)控機(jī)制的研究還很缺乏。水稻是世界三大糧食作物之一，水稻產(chǎn)量與世界糧食保障息息相關(guān)。近年來(lái)，我國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)秈稻品種利用硝酸鹽的能力顯著高于粳稻品種，并證明水稻編碼硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNRT1.1B的單堿基突變是導(dǎo)致秈稻和粳稻間氮肥利用效率差異的重要因素[26]。進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn)，OsNRT1.1B主要參與水稻對(duì)外界硝酸鹽刺激的初級(jí)應(yīng)答反應(yīng)，而OsNRT1.1A則參與水稻對(duì)細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽及銨鹽的利用，并發(fā)現(xiàn)在低氮條件下過(guò)表達(dá)OsNRT1.1A能顯著提高水稻的氮利用效率和產(chǎn)量[27]。此外發(fā)現(xiàn)，水稻G蛋白復(fù)合體中的γ亞基編碼基因DEP1對(duì)氮利用效率具有調(diào)控作用[28]。科學(xué)家們通過(guò)對(duì)谷氨酸合成酶突變體suppressor的篩選，發(fā)現(xiàn)葉綠體定位的ARE1 對(duì)水稻氮素利用效率具有調(diào)控作用[29]。這些研究對(duì)理解水稻氮代謝調(diào)控、提高水稻氮利用效率具有重要意義。

本課題組前期對(duì)擬南芥葉酸代謝突變體的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥材料葉酸代謝紊亂會(huì)引起氮代謝異常。為此推測(cè)植物葉酸代謝與氮代謝密切相關(guān)。葉酸屬于水溶性維生素B9，在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)主要通過(guò)介導(dǎo)一碳代謝轉(zhuǎn)移參與多種代謝途徑[14]。本研究在低氮條件下施加外源葉酸培養(yǎng)水稻幼苗的發(fā)現(xiàn)，施加葉酸能顯著促進(jìn)低氮條件下水稻的生長(zhǎng)發(fā)育(圖2)，初次發(fā)現(xiàn)葉酸具有提高水稻應(yīng)對(duì)低氮脅迫、促進(jìn)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的作用。

外源葉酸的施加顯著提高了水稻幼苗體內(nèi)葉酸含量、可溶性蛋白和游離氨基酸含量(圖4)，這與之前在擬南芥葉酰聚谷氨酸合成酶突變體dfb、dfc中的研究發(fā)現(xiàn)突變體中可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量均出現(xiàn)下降的現(xiàn)象較為一致[16-17]。通過(guò)對(duì)水稻氮代謝關(guān)鍵酶酶學(xué)活性發(fā)現(xiàn)，施加外源葉酸能促進(jìn)水稻幼苗體內(nèi)谷氨酸合酶GOGAT活性的增加、降低幼苗體內(nèi)亞硝酸根還原酶NiR活性(圖5)。基因表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)施加外源葉酸后水稻幼苗GOGAT基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖6)，推測(cè)外源葉酸通過(guò)提高GOGAT基因表達(dá)水平、促進(jìn)GOGAT活性的增加進(jìn)而影響植株的氮代謝。但葉酸作用于谷氨酸合酶GOGAT的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，低氮條件下水稻幼苗5-F-THF和5,10-CH=THF的含量較高(圖3)，表明葉酸代謝與植物氮代謝可能存在相互作用關(guān)系。上述研究結(jié)果將為進(jìn)一步深入解析葉酸參與植物氮代謝調(diào)控的分子機(jī)制，為深入理解植物氮代謝調(diào)控機(jī)制及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高作物氮利用效率提供新思路。