轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根的研究進(jìn)展

羅巧妮　黎世嬋　佘婷婷　生書(shū)晶

摘要? ? 何首烏毛狀根體系因?yàn)檫z傳穩(wěn)定、生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)，在次生代謝產(chǎn)物合成和提取方面具有優(yōu)勢(shì)。本文概述了何首烏毛狀根體系的誘導(dǎo)和培養(yǎng)過(guò)程、影響何首烏毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物積累的因素，并就何首烏毛狀根在生物轉(zhuǎn)化以及次生代謝工程方面的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞? ?何首烏;毛狀根;生物轉(zhuǎn)化;次生代謝工程

中圖分類號(hào)? ? R282.71? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）02-0054-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? Because of the characteristics of genetic stability and rapid growth，the hairy root system of Polygonum multiflorum has advantages in the synthesis and extraction of secondary metabolites.This paper summarized the induction and culture process of Polygonum multiflorum hairy roots，the factors affecting the growth of hairy roots and the accumulation of secondary metabolites and forecasted the application prospects of Polygonum multiflorum hairy roots in biotransformation and secondary metabolic engineering.

Key words? ? Polygonum multiflorum;hairy root;biotransformation;secondary metabolic engineering

何首烏是我國(guó)歷代常用的傳統(tǒng)中藥材，含有二苯乙烯苷類、蒽醌類、總糖及還原糖等重要化學(xué)成分，具有極大的藥用價(jià)值[1]。二苯乙烯苷作為何首烏的主要藥效成分，《中國(guó)藥典（2015年版）》將其確定為何首烏原藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)[2]。但是，因其為次生代謝產(chǎn)物，直接在何首烏中提取的量極微，因而利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速獲取二苯乙烯苷等有效成分成為一種研究趨勢(shì)。關(guān)于何首烏的組織培養(yǎng)，目前研究較多的為愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)以及毛狀根培養(yǎng)，兩者的培養(yǎng)體系目前均已相對(duì)成熟。但是由于二苯乙烯苷等有效成分主要在何首烏的塊根及老藤中積累，而何首烏毛狀根體系類似于何首烏的塊根組織，所以在有效成分的積累方面，毛狀根較之愈傷細(xì)胞具有優(yōu)勢(shì)。筆者多年來(lái)致力于何首烏二苯乙烯苷次生代謝途徑的研究，結(jié)合課題組研究成果，概述了何首烏毛狀根體系的誘導(dǎo)和培養(yǎng)過(guò)程、影響何首烏毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物積累的因素，并就何首烏毛狀根在生物轉(zhuǎn)化以及次生代謝工程方面的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1? ? 何首烏毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)

早在1998年，何首烏毛狀根培養(yǎng)被初次報(bào)道，施和平等[3]利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感染何首烏無(wú)菌葉片和葉柄，15 d后均能得到長(zhǎng)勢(shì)良好的毛狀根。其后，何首烏毛狀根被相繼研究和利用。總體來(lái)講，影響何首烏毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)的因素主要有農(nóng)桿菌菌種、菌體誘導(dǎo)方式、培養(yǎng)基等。

1.1? ? 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的選擇

不同菌株對(duì)何首烏毛狀根的誘導(dǎo)效果不同。目前研究報(bào)道，在何首烏毛狀根的誘導(dǎo)中使用較多的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株有ATCC15834、Rl601、LBA9402等，這些菌株中均含有侵入性農(nóng)桿堿型Ri致根質(zhì)粒。王? 莉等[4]利用發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402和R1601誘導(dǎo)何首烏無(wú)菌外植體得到了快速穩(wěn)定繁殖的何首烏毛狀根。朱寬鵬等[5]利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834建立了穩(wěn)定遺傳的毛狀根體系，并利用該體系進(jìn)行了外源基因的超表達(dá)和RNA干擾，獲得了較好的效果。雖然在其他藥用植物毛狀根誘導(dǎo)過(guò)程中也有發(fā)根農(nóng)桿菌K599、A4等菌株的報(bào)道，但是在何首烏中其他菌株的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

1.2? ? 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株的方法

發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株的常用方法有直接注射法和接種感染法。直接注射法是用活化好的新鮮菌液對(duì)無(wú)菌幼苗進(jìn)行2～3次注射，注射處往往在2周內(nèi)會(huì)產(chǎn)生毛狀根。接種感染法則是將何首烏無(wú)菌外植體切割后，放入已活化的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液共孵育，然后接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，一般2～4周后可以誘導(dǎo)出毛狀根。如今多數(shù)研究均采用接種感染法轉(zhuǎn)化何首烏外植體，因?yàn)橥? 莉等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與直接感染法相比，接種感染法誘導(dǎo)率相對(duì)較高，但由于該法菌侵染的概率較大，后期可能會(huì)導(dǎo)致除菌困難。

1.3? ? 培養(yǎng)基的選擇

多項(xiàng)研究表明，MS培養(yǎng)基是目前最適合何首烏毛狀根生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。邱立鵬[6]在試驗(yàn)中比較了MS、1/2MS、B5和White 4種不同培養(yǎng)基對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)40 d的培養(yǎng)，毛狀根在MS培養(yǎng)基的增長(zhǎng)倍數(shù)最高;嚴(yán)春艷等[7] 也進(jìn)行了類似試驗(yàn)，并繪制了生長(zhǎng)曲線，也發(fā)現(xiàn)毛狀根在MS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線高于其他3個(gè)，說(shuō)明MS培養(yǎng)基最適合轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根的生長(zhǎng)。MS培養(yǎng)基屬于高鹽濃度的培養(yǎng)基，含有較高濃度的NH4+、NO3-、PO43-、Ca2+等無(wú)機(jī)鹽和離子，究其原因可能是何首烏毛狀根生長(zhǎng)比較旺盛，需要MS這樣的高鹽度培養(yǎng)基提供充足的營(yíng)養(yǎng)。

2? ? 影響毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物形成的因素

毛狀根培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于提高藥用植物的有效藥成分含量，通過(guò)控制不同的培養(yǎng)條件，添加相應(yīng)的化學(xué)因子可以達(dá)到提高次生代謝產(chǎn)物的目的。目前，對(duì)于毛狀根培養(yǎng)的影響因素，研究較多的有光照、pH值、溫度等物理因素以及外源添加激素、誘導(dǎo)子等化學(xué)因子。由于目前對(duì)何首烏毛狀根的培養(yǎng)影響因素沒(méi)有系統(tǒng)全面的試驗(yàn)研究，本文結(jié)合其他藥用植物在該領(lǐng)域的研究，指出可能影響何首烏毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物形成的因素。

2.1? ? 物理因子

光照、溫度、pH值以及培養(yǎng)基中的碳源和氮源等都會(huì)影響毛狀根的生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物的合成，良好的毛狀根體系往往是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果。楊? 睿等[8]研究了影響水母雪蓮毛狀根生長(zhǎng)和總黃酮生物合成的理化因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合適的碳源和氮源濃度、添加一定的激素、24 ℃培養(yǎng)并給予一定的光強(qiáng)、pH值為5.8時(shí)最有利于毛狀根的生長(zhǎng)及總黃酮的生物合成;除了上述條件，搖床轉(zhuǎn)速也會(huì)影響其生長(zhǎng)和代謝。在何首烏的毛狀根培養(yǎng)中，還未見(jiàn)對(duì)特定物理因素如光照、溫度、pH值等的綜合研究。潘瑞幟等[3]誘導(dǎo)何首烏毛狀根采用的是光強(qiáng)2 000 lx、光照時(shí)間14 h/d，1個(gè)月后誘導(dǎo)得到何首烏毛狀根;王? 莉等[4]則是采用25 ℃暗培養(yǎng)40 d，對(duì)于光照如何影響何首烏毛狀根的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，甚至對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的合成有沒(méi)有影響，至今還未見(jiàn)報(bào)道，下一步研究可以對(duì)其進(jìn)行深入探討。

2.2? ? 化學(xué)因子

2.2.1? ? 外源激素。雖然毛狀根在不添加外源激素的情況下也能快速生長(zhǎng)，但其次生代謝產(chǎn)物的形成和積累離不開(kāi)激素。不同的激素可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中不同的酶體系影響次生代謝產(chǎn)物的形成[8]。因此，可以通過(guò)添加外源激素以及調(diào)節(jié)激素的濃度和比例，提高毛狀根中目標(biāo)活性成分的積累，從而有利于人們對(duì)藥用植物活性成分的大量提取。于榮敏等[9]在試驗(yàn)中研究了3種常見(jiàn)的外源激素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAA、2，4-D會(huì)促進(jìn)何首烏毛狀根的生長(zhǎng)，而6-BA則會(huì)抑制何首烏毛狀根的生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物蒽醌類的積累。

2.2.2? ? 誘導(dǎo)子。在培養(yǎng)基中添加的可以刺激毛狀根產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)或生物因子就是誘導(dǎo)子。酵母提取物、茉莉酸甲酯、水楊酸等多種物質(zhì)常常被作為誘導(dǎo)子對(duì)藥用植物毛狀根中的活性成分進(jìn)行刺激合成。張金家等[10]考察了酵母提取物、茉莉酸甲酯、水楊酸和銀離子等誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根及其中丹酚酸的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根的生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響;茉莉酸甲酯和水楊酸能提高丹酚酸的含量，酵母提取物反而會(huì)降低丹酚酸，Ag+無(wú)顯著影響。郭? 雙等[11]在研究誘導(dǎo)子對(duì)顛茄毛狀根的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，AgNO3是提高顛茄毛狀根中托品烷類生物堿含量的最佳誘導(dǎo)子，酵母提取物可以同時(shí)促進(jìn)顛茄毛狀根的生長(zhǎng)及其次生代謝。關(guān)于何首烏誘導(dǎo)子的研究報(bào)道還不多見(jiàn)，嚴(yán)春艷等[7]發(fā)現(xiàn)，水楊酸、茉莉酮酸甲酯這2種誘導(dǎo)子會(huì)抑制何首烏毛狀根的生長(zhǎng)，但誘導(dǎo)子對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的影響還未見(jiàn)報(bào)道。

3? ? 何首烏毛狀根的生物轉(zhuǎn)化

生物體系中會(huì)存在各種各樣的酶，而這些酶系統(tǒng)能夠?qū)ν庠葱缘孜镞M(jìn)行糖基化、羥基化、甲基化、氧化、還原等結(jié)構(gòu)修飾，即為生物轉(zhuǎn)化。由于多酶催化作用的不確定性，還可能產(chǎn)生一些新的活性物質(zhì)。朱建華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根可以將青蒿酸轉(zhuǎn)化為3個(gè)青蒿素類化合物和1個(gè)羥基化產(chǎn)物;嚴(yán)春艷等[13]利用轉(zhuǎn)基因何首烏毛狀根對(duì)青蒿素等8種活性化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)底物發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化;鄧文娟等[14]研究顯示，瑞香素在何首烏毛狀根懸浮培養(yǎng)體系中發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，生成了瑞香素-8-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅱ）。另外，還有關(guān)于何首烏毛狀根對(duì)于麝香草酚、氯代香豆素、倍半萜類化合物[15-16]等物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，都得到了不同程度的糖基化、氧化、還原等反應(yīng)底物，可見(jiàn)何首烏在生物轉(zhuǎn)化方面有著廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)于豐富新化合物資源，甚至研制開(kāi)發(fā)新藥都是一個(gè)可行的方法，值得進(jìn)一步研究挖掘。

4? ? 何首烏毛狀根在代謝工程方面的研究

藥用植物次生代謝工程是利用基因工程的手段對(duì)次生代謝途徑進(jìn)行修飾、調(diào)控甚至改變，以期提高次生代謝產(chǎn)物的含量。何首烏含有二苯乙烯苷、蒽醌類等次生代謝產(chǎn)物，有利于提高植物的抗逆性，并且在治療心血管疾病、炎癥等方面表現(xiàn)出較好的效果，但是由于次生代謝產(chǎn)物含量的局限，次生代謝工程成為解決這一問(wèn)題的有效途徑。筆者前期研究表明[5]，芪合酶是何首烏二苯乙烯苷合成途徑的關(guān)鍵酶，將含有芪合酶基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和RNA干擾載體導(dǎo)入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834中，轉(zhuǎn)化何首烏外植體誘導(dǎo)生成毛狀根，結(jié)果表明，芪合酶過(guò)表達(dá)的何首烏毛狀根中二苯乙烯苷含量是空白組的2.41倍，而RNA干擾組則二苯乙烯苷合成明顯減少。

5? ? 總結(jié)及展望

現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)證明何首烏中二苯乙烯苷等次生代謝產(chǎn)物的諸多功效，但是由于次生代謝產(chǎn)物含量較低，原植物提取含量有限，獲得生長(zhǎng)迅速、穩(wěn)定遺傳的毛狀根成為何首烏有效成分提取的一個(gè)重要來(lái)源。但目前對(duì)于影響何首烏毛狀根生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物形成的因素研究還不夠深入，有待進(jìn)一步研究。利用何首烏毛狀根進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究越來(lái)越多，給未來(lái)利用何首烏毛狀根進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化提供了可能。而隨著次生代謝工程研究的深入，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因改良的何首烏毛狀根，從而在根源上提高二苯乙烯苷等有效成分的含量，也為將來(lái)大量獲取有效成分提供了一條便捷的途徑[17]。

6? ? 參考文獻(xiàn)

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