防治辣椒疫病的生防菌培養(yǎng)條件優(yōu)化與菌劑復配

付博　王家哲　張鋒　李英梅　楊藝煒　任平

摘要? ? 為研制對辣椒疫病具有明顯防治效果且田間穩(wěn)定性好的生防菌劑，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了美麗短芽孢桿菌NF2、多黏類芽孢桿菌J和枯草芽孢桿菌Q14的培養(yǎng)條件，并進一步篩選了3種芽孢桿菌組成的復合生防菌劑配比方式。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，3種芽孢桿菌的活菌數(shù)均可穩(wěn)定在2.0×108 CFU/mL以上，當菌株NF2、J和Q14的活菌數(shù)分別為1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL，按照1∶1∶1體積比配比制備時，與清水對照相比，復合生防菌劑可促進辣椒增產(chǎn)39.2%，對辣椒疫病的防效大于70%，并可在根際土壤中穩(wěn)定存活和繁殖100 d以上。

關(guān)鍵詞? ? 辣椒疫病;芽孢桿菌;復合生防菌劑;培養(yǎng)條件;復配

中圖分類號? ? S939.92? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）02-0084-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

辣椒疫病俗稱“死秧病”，是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）引起的一種具有毀滅性的土傳病害，其發(fā)病周期短、發(fā)病率高，是辣椒產(chǎn)區(qū)的主要常見病害，并可在黃瓜、番茄、西瓜等多種作物中侵染傳播[1-2]。目前，生產(chǎn)上主要采用抗病品種選育、耕作措施改良以及施用化學藥劑等方法來進行病害防治，盡管具有一定的防治效果，但是受農(nóng)藥殘留、生產(chǎn)成本高等因素的影響，目前仍需要探索高效、環(huán)保的綠色防控技術(shù)[3-4]。

近年來，國內(nèi)外學者已經(jīng)篩選了不同種類的細菌、放線菌、真菌用于辣椒疫病防治。生防菌可通過代謝產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)、與病原菌產(chǎn)生拮抗作用等方式達到防病促生的作用，且由于其對環(huán)境無污染、無耐藥性等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景[5-6]。但是生防菌在田間的穩(wěn)定性和菌株的定殖能力是影響其穩(wěn)定發(fā)揮生防效果的重要因素。因此，有必要進一步研發(fā)抗逆性好、防效穩(wěn)定的復合生防菌劑。

鑒于此，本文通過優(yōu)化3種生防芽孢桿菌的培養(yǎng)條件、優(yōu)化不同菌株配比方式，以期獲得具有較高活菌數(shù)、產(chǎn)芽孢抗逆性好的復合生防菌劑，充分發(fā)揮多種生防菌協(xié)同抗病的優(yōu)勢，保證生防菌劑在田間發(fā)揮穩(wěn)定的防效。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗地點

試驗在陜西省科學院渭南科技示范基地（陜西省渭南市大荔縣）的溫室大棚進行。

1.2? ? 試驗材料

試驗菌種有美麗短芽孢桿菌NF2、枯草芽孢桿菌Q14，為本實驗室保藏菌種;多黏類芽孢桿菌J，由西北大學生命科學學院分子微生物學實驗室饋贈。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨營養(yǎng)瓊脂[7]、GB培養(yǎng)基[8]、PDA培養(yǎng)基[7]，均按照文獻中描述的方法配制。

試驗儀器有電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9402，上海一恒科技有限公司）、恒溫搖床（QYC-200，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、離心機（GL-20M，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、生物顯微鏡（BX41-32P02，奧林巴斯）等。

1.3? ? 試驗方法

1.3.1? ? 菌株Q14、J和NF2的培養(yǎng)條件優(yōu)化。試驗前期已經(jīng)初步確定了3種芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)溫度、pH值和接種時間。本試驗主要對菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分中的氮源、碳源、無機鹽進行正交分析[9]和優(yōu)化，以期獲得較高活菌數(shù)的發(fā)酵產(chǎn)品。

（1）菌株Q14的最佳培養(yǎng)條件。試驗根據(jù)無機鹽、N源、C源添加量的不同，設(shè)9個處理，具體如表1所示。

（2）菌株NF2的最佳培養(yǎng)條件。試驗根據(jù)無機鹽、N源、C源添加量的不同，共設(shè)9個處理，各處理的無機鹽、N源、C源的添加量同菌株Q14，具體如表1所示。

（3）菌株J的最佳培養(yǎng)條件。試驗根據(jù)無機鹽、N源、C源的不同，共設(shè)16個處理，具體如表2所示。

1.3.2? ? 3種不同芽孢桿菌的復配。將3種芽孢桿菌的發(fā)酵液稀釋為不同活菌數(shù)，按照1∶1∶1的體積比進行配比，采用3因素3水平正交分析的方法，設(shè)計3種不同芽孢桿菌配比方案，制備復合生防菌劑，另設(shè)清水對照處理。具體設(shè)計方案如表3所示。

1.3.3? ? ?復合生防菌劑的生防效果及田間穩(wěn)定性分析。小區(qū)試驗在溫室大棚進行，試驗共設(shè)3個處理，即處理T：將不同配比的復合生防菌劑施用于辣椒苗，并全部回接辣椒疫霉進行侵染;CK1：不施用生防菌劑，施用清水，但被辣椒疫霉侵染;CK2：既不施用生防菌劑，也不侵染病菌。3次重復，小區(qū)面積27 m2（3.6 m×7.5 m）。統(tǒng)計復合生防菌劑的生防效果并對其田間穩(wěn)定性進行分析[10]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 菌株Q14的最佳培養(yǎng)條件

在30 ℃、培養(yǎng)時間48 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下，采用L9（33）正交試驗分析，結(jié)果如表4所示?？梢钥闯?，處理4（營養(yǎng)成分為NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、玉米粉20 g/L，pH值7.0～7.2）菌株Q14的活菌數(shù)最高。然而，由于在實際操作過程中，玉米粉難溶于水，發(fā)酵前首先需要將玉米粉進行糖化，增加生產(chǎn)成本。因此，在發(fā)酵過程中用葡萄糖10 g/L替換了玉米粉20 g/L，3次重復試驗結(jié)果顯示，活菌數(shù)也可達到 2.5×109 CFU/mL，與添加玉米粉20 g/L碳源培養(yǎng)結(jié)果無顯著性差異。最終確定菌株Q14的最佳培養(yǎng)條件為NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，pH值7.0～7.2，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時間48 h，產(chǎn)芽孢率可達90%。

2.2? ? 菌株NF2的最佳培養(yǎng)條件

在30 ℃、培養(yǎng)時間48 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，采用 L9（33）正交試驗分析，結(jié)果如表5所示。可以看出，處理7（營養(yǎng)成分為 MgSO4 0.2 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，pH值7.0～7.2）菌株NF2的活菌數(shù)最高，可達4.0×109 CFU/mL，3次重復驗證結(jié)果一致，培養(yǎng)72 h后菌株NF2的產(chǎn)芽孢率可達90%。

2.3? ? 菌株J的最佳培養(yǎng)條件

在30 ℃、培養(yǎng)時間48 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下，采用L16（43）正交試驗分析，結(jié)果見表6?？梢钥闯?，處理4（營養(yǎng)成分為NaCl 5 g/L、尿素5 g/L、蛋白胨10 g/L、淀粉15 g/L，pH值7.0～7.2）菌株J的活菌數(shù)最高，可達2.6×108 CFU/mL以上，3次重復驗證結(jié)果一致，培養(yǎng)48 h后菌株J的產(chǎn)芽孢率可達100%。

2.4? ? 生防菌劑復配條件優(yōu)化

將3種不同的芽孢桿菌配制成不同活菌數(shù)的菌液，采用L9（33）正交試驗分析，辣椒產(chǎn)量結(jié)果如表7所示?？梢钥闯?，當菌株NF2、J和Q14的活菌數(shù)分別為1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL、按照1∶1∶1體積配比時，能顯著提高辣椒植株產(chǎn)量，每株辣椒的產(chǎn)量達到0.394 kg，折產(chǎn)約24 t/hm2，與清水對照組（單株產(chǎn)量0.283 kg，折合產(chǎn)量17 205 kg/hm2）相比，約增產(chǎn)39.2%，3次重復驗證結(jié)果一致，確定處理8為復合生防菌劑的最佳配比。

2.5? ? 復合生防菌劑的生防效果及田間穩(wěn)定性

由表8可知，與CK1相比，處理T相對防效可達70.4%，病情指數(shù)為17.0，顯著降低。施用復合生防菌劑100 d后，對辣椒根際芽孢桿菌進行分離篩選，結(jié)果顯示，與CK1相比，芽孢桿菌的活菌數(shù)提高近1倍，說明該復合生防菌劑在根際土壤中可存活、繁殖，田間穩(wěn)定性較好。

3? ? 結(jié)論與討論

本試驗通過采用正交統(tǒng)計分析方法，確定了菌株NF2、J和Q14的最佳培養(yǎng)條件，為制備具有較高活菌數(shù)和產(chǎn)芽孢率的生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。通過對復配條件進行優(yōu)化，確定當菌株NF2、J和Q14的活菌數(shù)分別為1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL時，按照1∶1∶1的體積比配比制備的復合生防菌劑能顯著促進辣椒產(chǎn)量，對辣椒疫病具有明顯的防效，并可在根際土壤中穩(wěn)定存活和繁殖。

復合生防菌劑的優(yōu)勢在于能夠避免單一菌劑在田間穩(wěn)定性差的缺陷，充分發(fā)揮多菌株協(xié)同作用，進一步加強和穩(wěn)定田間防效。目前，已有多篇報道證明了復合生防菌劑的生防效果，充分說明了復合生防菌劑是未來微生物制劑應用的趨勢[11-12]。本試驗結(jié)果為復合生防菌劑配制提供了理論基礎(chǔ)，后續(xù)將進一步開展生防機理和大田試驗研究，以推動生防菌的應用。

4? ? 參考文獻

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