細胞色素B基因檢測方法在物種鑒定中的應用

王 璐,馮 慧,馮成利

(陜西省動物研究所,陜西 西安 710032)

野生動物的非法獵殺、貿易等情況一直存在，而一些繳獲的非法貿易動物因為外形遭到破壞，無法從形態上進行準確的鑒定，對于森林公安的執法造成一定的影響。因此通過對動物的皮毛、血液以及肌肉等進行分子檢測，得到準確的鑒定結果會對野生動物保護和打擊非法經營和走私野生動物活動有著重要的意義[1～3]。同理動物肉制品因為屬于一種半加工過的食品，存在著造假、以次充好的現象，常規的檢測無法進行有效的鑒定，而DNA水平的檢測將會很好地解決這一難題。

細胞色素B(Cyto chrome b, Cytb)基因位于線粒體環狀DNA中，是編碼線粒體內膜上細胞色素b氧化酶的基因的一個亞基，由線粒體DNA H鏈所編碼。它的起源非常古老，在幾乎所有的真核生物和許多原核生物中都有發現，它不但在屬間、種間存在多樣性，而且在品種間、品種內個體間都存在多樣性，因此Cytb基因是研究種間進化關系的最佳基因之一[4～5]。通過對物種Cytb基因的檢測對比，可以準確地對其進行鑒別分類。

1 材料和方法

1.1 材料

研究的實例樣品分別來自兩方面，一方面是陜西省森林公安送檢的非法貿易動物肌肉樣品，另一方面是從附近的串串店取材的肉質食品。

1.2 方法

1.2.1 總基因組DNA的提取以及PCR擴增 用Promega試劑盒提取樣品DNA，提取出來后取5 μL，用1%瓊脂糖電泳進行檢測，其余-20℃保存。

PCR擴增的目的片段為線粒體DNA細胞色素B基因部分片斷序列，大小約460bp，引物選取線粒體DNACytb通用引物進行擴增。

表1 樣品信息

(S0609-1189F)Cytb-F 5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'

(S0609-1189R)Cytb-R 5'-CTCACCTGATATTTGTCCTCA-3

'PCR反應在PTC-200 PCR儀(BIO-RAD)中進行，擴增條件如表2。將PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，-20℃保存。

1.2.2 PCR產物測序 將得到的PCR產物按照96孔純化板純化操作后，進行測序。測序反應體系為：2 uL Mix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、H2O)，2 uL純化后的產物，1 uL引物(5 mmol·L-1)。測試反應程序為：循環條件95℃ 15s，(95℃ 15s 50℃ 5s 60℃ 90s)x35循環，終止反應。

2 結果與分析

2.1 森林公安送檢樣品

將樣品測出來的Cytb基因序列與基因庫里的標準序列進行對比，得到的進化樹關系圖分別如圖1、圖2、圖3。

可以看出樣品J1、J2都是與野豬的遺傳的距離最為接近，J3與羊的遺傳的距離最為接近。再進行一對一的序列比對，發現測出來Cytb基因序列匹配率都在99%以上，因此可以判定森林公安送檢的J1、J2是野豬，J3就是普通的山羊。

表2 PCR反應體系及條件

2.2 串串店所提取肉制食品樣品

提取的肉質食品樣品都是已知的，因此將四個樣品分別羊、牛、豬和雞的標準Cytb基因序列進行比對，結果如表3。經過檢測我們發現R1、R2、R3的檢測結果表明沒有問題，但是R4檢測出來并不是雞肉，而是牛肉。

表3 肉質食品樣品Cytb基因序列對比

3 分析討論

運用細胞色素B基因檢測方法對動物肉制食品的的真假鑒定相對簡單，一是動物肉制食品都是比較常見的物種，檢測范圍比較小；另外一個方面我們只需將要檢測肉制食品樣品與標準Cytb基因序列進行一對一的比對，序列匹配就說明是真的，反之證明是假的。而非法貿易野生動物的Cytb基因序列鑒定則要建立在有一個標準Cytb基因序列庫基礎上，將未知動物樣品帶入進行比對，從而得出正確的結果。相對于普通的形態學鑒定，分子鑒定手段在物種鑒定方面更為準確，而且隨著生物技術的不斷發展，包含細胞色素B基因檢測方法在內的DNA鑒定方法也在不斷進步，我們堅信在未來DNA分子技術將會在物種鑒定方面發展的更為迅捷、有效，為打擊野生動物非法貿易以及食品安全提供有力的技術支撐。