基于生物分子網絡和分子對接研究槲皮素抗宮頸癌的機制

朱曉芹，劉志強，王博龍*

1宜春學院化學與生物工程學院，宜春 336000；2鶴壁職業技術學院，鶴壁 458000

在全球范圍內，宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，高居女性惡性腫瘤的第2位，是一種嚴重危害女性健康的疾病。臨床上早期宮頸癌治療以手術為主，但宮頸癌起病隱匿，不同地區的篩查手段及技術差異使得半數以上的患者就診時已處于中晚期[1,2]。中晚期宮頸癌治療以放化療為主，手術為輔，然而宮頸癌是對放射線中等敏感的實體腫瘤，對于年輕女性患者，放療還會損傷卵巢，導致卵巢早衰等一系列并發癥。化療藥物不僅毒副作用大，而且部分毒副作用跟放療副作用重疊，一般患者難以耐受。因此，仍需努力尋找高效低毒的抗宮頸癌藥物。

槲皮素(quercetin)是一種廣泛分布于蔬菜、水果及多種中草藥的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗菌及清除自由基等藥理作用。大量流行病學證據表明，多食富含槲皮素的水果和蔬菜可以預防多種癌癥的發生[3]，而槲皮素本身抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、調節細胞周期的顯著作用，也在多種癌株的體內外實驗中得到證實。近年來，槲皮素在宮頸癌放化療上的雙重作用引起了越來越多的關注，但具體機制尚未完全明確。本研究借助生物分子網絡系統整合的大量生物信息及數據，挖掘槲皮素抗宮頸癌靶點，進行GO(Gene Ontology)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，篩選主要靶點與槲皮素進行分子對接，以期全面解析槲皮素抗宮頸癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

(1)活性成分靶點數據庫：中藥系統藥理學數據庫與分析平臺，TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/ tcmsp.php)；Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetsprediction.ch/)；毒性與基因比較數據庫CTD(http://ctdbase.org/)。(2)蛋白質數據庫，UniProt(https://www.uniprot.org/)；PDB(http://www.rcsb.org/)。(3)疾病靶點數據庫：GeneCards(https://www.genecards.org/)；DisGeNET(http://www.disgenet.org/)；Open Targets Platform(https://www.targetsvalidation.org)。(4)蛋白質相互作用分析平臺，STRING(https://string-db.org/)。(5)生信在線分析平臺：OmicShare云平臺(http://omicshare.com/)；DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)。(6)網絡分析及作圖軟件Cytoscape 3.6.1；Venny 2.1.0(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html)；ChemBioOffice 2014。(7)分子對接相關軟件：分子三維結構處理軟件PyMOL；AutoDuck Vina[4]及AutoDuck Tools。

1.2 槲皮素抗宮頸癌靶點篩選及其網絡構建

將槲皮素輸入TCMSP數據庫檢索其作用靶點；運用Swiss TargetPrediction服務器的藥效團模型和基于配體分子相似性，預測槲皮素作用靶點；在CTD數據庫中選取槲皮素匹配度高的前200個靶點，將以上三個來源的靶點合并去重后得到槲皮素作用靶點。分別在GeneCards、DisGeNET、Open Targets數據庫中檢索宮頸癌相關靶點，將每個數據庫獲得的靶點按照相關度打分，從高到低選取分值前200個靶點，合并去重后得到宮頸癌靶點。再將宮頸癌靶點與槲皮素靶點輸入Venny 2.1.0軟件，取交集部分作為槲皮素抗宮頸癌靶點，并導入 Cytoscape 3.6.1 軟件構建槲皮素-抗宮頸癌靶點網絡。

1.3 槲皮素抗宮頸癌靶點相互作用網絡構建

將槲皮素抗宮頸癌靶點導入STRING平臺構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence=0.4”，其他參數保持默認值。將 PPI 網絡導入Cytoscape 3.6.1軟件，利用“Network Analysis”功能計算各網絡節點的度值(Degree)、介數(Betweenness)及最短路徑(Closeness)等拓撲參數，節點的Degree、Betweenness、Closeness越大，該節點在網絡中的位置就越重要。選取Degree、Betweenness、Closeness同時在平均值之上的靶點作為槲皮素抗宮頸癌的主要靶點。

1.4 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將槲皮素抗宮頸癌靶點輸入OmicShare和DAVID 6.8平臺，分別進行槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集分析與KEGG通路富集分析，依據P-value<0.001和P-value<0.05篩選槲皮素抗宮頸癌靶點富集的生物功能及信號通路。

1.5 槲皮素抗宮頸癌主要靶點的分子對接

在PDB數據庫搜索槲皮素抗宮頸癌前十個主要靶點的蛋白晶體復合物，借助PyMOL軟件將靶蛋白與原配體分離，同時去除靶蛋白中的水分子、磷酸根以及多余的非活性配體，在AutoDuck Tools軟件中對處理后靶蛋白進行加氫、加電荷等操作。將槲皮素的2D結構導入ChemBio3D軟件，以mol2的格式保存其3D結構，將靶蛋白、原配體、槲皮素的3D結構統一設置成AutoDuck Tools軟件可識別的pdbqt格式，以原配體所在位點為靶蛋白的活性口袋，分別進行靶蛋白與槲皮素、原配體的分子對接，對比分析原配體、槲皮素與各靶蛋白的親和力。

2 結果

2.1 槲皮素抗宮頸癌靶點及其網絡構建

分別從TCMSP、Swiss TargetPrediction、CTD數據庫篩得靶點96、100、200個，合并去重后確定槲皮素靶點為311個；分別從GeneCards、DisGeNET、Open Targets 三個數據庫各取前200個靶點，合并去重后確定宮頸癌靶點為460個，再將311個成分靶點與460個疾病靶點取交集，得到槲皮素抗宮頸癌靶點97個(圖1)。將槲皮素及97個抗宮頸癌靶點導入 Cytoscape 3.6.1 軟件，得到槲皮素-抗宮頸癌靶點網絡(圖2)。

圖1 槲皮素-抗宮頸癌靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of quercetin-anticervical cancer targets

2.2 槲皮素抗宮頸癌靶點的PPI網絡

如圖3所示，每個參與互作的靶點用一個圓圈表示，圓圈面積越大表示其Degree越大，圓圈周線越粗代表其Betweenness越大。PPI網絡中共有97個節點，2 311條相互作用連線，平均Degree為47.65，平均Betweenness為5.31×10-3，平均Closeness為6.80×10-1，Degree、Betweenness、Closeness同時在平均值之上的靶點有29個(表1)。29個主要靶點包括調控轉錄及凋亡TP53、MYC、AKT1、CASP3、CASP8、CTNNB1、CYCS、EP300、ERBB2、MAPK1、MAPK3、SRC、STAT3；調控炎癥反應IL6、TNF、PTGS2、IL1B、CXCL8 ；參與血管生成EGF、EGFR、VEGFA；調控細胞周期CCND1、CDKN2A、PTEN ；以及性激素受體AR、ESR1和其它。

圖2 槲皮素-抗宮頸癌靶點網絡Fig.2 The network of quercetin-anticervical cancer targets注：箭頭表示槲皮素，三角形表示宮頸癌靶點。Note:The arrow represents quercetin and the triangle represents the targets of cervical cancer.

表1 主要靶點及其拓撲參數

圖3 蛋白互作網絡Fig.3 The network of protein-protein interaction

2.3 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集

依據P-value<0.001篩選出GO條目525個，其中生物過程(Biology Process)473個，分子功能(Molecular Function)30個，細胞組成(Cellular Componet)22個。如圖4所示，生物過程主要涉及刺激反應、生物過程調節、細胞增殖、細胞代謝、生物粘附等；分子功能及細胞組成主要涉及抗氧化活性、催化活性、細胞膜、細胞器等。進一步富集發現GO條目主要聚集在細胞增殖、凋亡、死亡、代謝等方面(圖5)，說明槲皮素可能通過調控細胞增殖、凋亡、代謝等發揮抗宮頸癌作用。

2.4 槲皮素抗宮頸癌靶點的KEGG通路

依據P-value<0.05篩得槲皮素抗宮頸癌靶點KEGG通路22條(表2)，圖6為各通路富集氣泡圖，富集因子(Rich factor)是槲皮素富集在通路下的靶點與該通路所有蛋白的比值，比值越大表示富集度越大。P-value取值范圍[0，1]，顏色越紅表示P-value越小，富集越明顯。點的大小表示槲皮素富集在通路下的靶點個數，點越大表示富集靶點越多。由圖可知，富集因子較大的通路包括與腫瘤細胞增殖、凋亡、轉錄密切相關的p53信號通路、FoxO信號通路、Apoptosis通路、TNF信號通路、mTOR信號通路；與腫瘤血管新生及微環境形成相關的HIF-1信號通路、VEGF信號通路。其中癌癥通路富集的靶點最多，p53信號通路的富集因子最大。如圖7所示，p53信號通路上富集的槲皮素抗宮頸癌靶點有細胞周期相關的p21、CyclinD、CyclinB、CDK2、Cdc2；細胞凋亡相關的Fas、Bax、CASP3、CASP8、CASP9、CytC、IGF及IGF-BP3等，說明它們與槲皮素調控細胞周期及細胞凋亡的作用密切相關。

2.5 槲皮素抗宮頸癌主要靶蛋白的分子對接

由表3可知，除4KZN靶蛋白外，其余9個靶蛋白與槲皮素結合能均<-5 kcal/mol，其中Myc原癌基因蛋白(圖8)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(圖9)及信號轉導及轉錄激活蛋白3(圖10)與槲皮素的結合能最低，分別為-8.2、-7.9、-7.9 kcal/mol，說明上述靶蛋白與槲皮素親和力最高，它們與槲皮素相互作用的氨基酸殘基如表4所示。

圖4 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能分析Fig.4 Analysis of GO function of quercetin-anticervical cancer targets

圖5 槲皮素抗宮頸癌靶點的GO功能富集Fig.5 GO enrichment of quercetin-anticervical cancer targets

表2 KEGG信號通路信息

圖6 槲皮素抗宮頸癌靶點的通路富集Fig.6 Pathways enrichment of quercetin-anticervical cancer targets

圖7 p53信號通路分析Fig.7 The analysis of p53 signaling pathway注：★代表槲皮素在p53通路的靶點。Note :★represents targets of quercetin of enrichment in the p53 pathway.

3 討論

天然產物是抗癌藥物發掘的重要源泉，紫杉醇、長春堿、喜樹堿、高三尖杉酯堿及人參皂苷Rg3等植物源性小分子已廣泛應用于癌癥臨床治療[5]。槲皮素是自然界廣泛分布的天然黃酮類物質，多項研究[6,7]表明其抗癌活性明顯，國外I和II期臨床試驗證實槲皮素能夠抑制多種腫瘤進展[8]。國內研究主要集中在槲皮素抗宮頸癌方面，如Zhang等[9]發現槲皮素可上調Caspase-3、Caspase-9的表達，誘導宮頸癌細胞C33A凋亡，下調cyclin D1的表達，抑制宮頸癌細胞SiHa、C33A的活力和增殖。Zhu等[10]發現槲皮素通過上調Caspase-3，下調中期因子(Midkine，MK)的表達，顯著抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，并誘導其凋亡。上述研究大多側重于細胞凋亡及細胞周期的個別蛋白，不足以系統揭示槲皮素抗宮頸癌的復雜機制。

表3 槲皮素與主要靶蛋白的分子對接

表4 靶蛋白氨基酸殘基

圖8 Myc原癌基因蛋白的分子對接模型Fig.8 The docking model of Myc proto-oncogene protein

圖9 RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的分子對接模型Fig.9 The docking model of RAC-alpha serine/threonine-protein kinase

圖10 信號轉導及轉錄激活蛋白3的分子對接模型Fig.10 The docking model of signal transducer and activator of transcription 3

本研究檢索多個化合物靶點數據庫、疾病靶點數據庫，挖掘出97個槲皮素抗宮頸癌靶點。借助蛋白互作篩出29個主要靶點，按照其功能可分為調控轉錄及凋亡的TP53、MYC、AKT1、CASP3、CASP8、CTNNB1、CYCS、EP300、ERBB2、MAPK1、MAPK3、SRC、STAT3；調控細胞周期CCND1、CDKN2A、PTEN ；參與血管生成的EGF、EGFR、VEGFA；調控炎癥反應的IL6、TNF、PTGS2、IL1B、CXCL8 ；以及性激素受體AR、ESR1等，說明槲皮素抗宮頸癌機制除了誘導凋亡、阻滯周期外，還包括抗血管生成、調控炎癥等其它機制。選取主要靶點中的前十個與槲皮素進行分子對接，結果發現其與MYC、STAT3及AKT1三個靶點的親和力最高。MYC屬于編碼核蛋白的癌基因，其家族基因及產物可促進細胞增殖，永生化，去分化以及轉化等，在多種腫瘤形成過程中處于重要地位。Cui等[11]發現調節C-Myc可誘導宮頸癌細胞G2/M期阻滯和細胞死亡，另有研究[12]證實槲皮素能抑制MYC基因結合位點的活性，阻止Myc向染色質穩定募集，使其不能促進多能干細胞形成以及驅動腫瘤發生。STAT3被認為在多種惡性腫瘤中發揮重要作用，靶向STAT3被認為是一種干預治療途徑，Chen等[13]實驗證實槲皮素不僅從基因轉錄方面抑制STAT3 mRNA的表達,而且還能抑制Stat3蛋白激酶的活化，從而誘導宮頸癌細胞凋亡。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的AKT1可以抑制細胞凋亡，促進細胞周期運行及細胞侵襲和轉移，Liu等[14]發現環氧合酶-2抑制劑通過下調AKT1蛋白表達而抑制宮頸癌HeLa細胞增殖。但尚未見到槲皮素可否通過AKT1作用于宮頸癌的相關報道，本文分子對接為進一步探尋槲皮素抗宮頸癌機制提供了線索。

KEGG分析發現槲皮素靶點主要富集在p53信號通路、Apoptosis通路、PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT 信號通路等。其中富集因子最大的p53信號通路作用廣泛，涉及細胞周期、細胞凋亡、腫瘤血管生成及轉移抑制、DNA的修復及損傷防御等，Vidya等[15]證實槲皮素通過p53依賴機制，誘導宮頸癌HeLa細胞G2/M期阻滯及線粒體凋亡，以劑量依賴的方式抑制HeLa細胞存活。Xiang等[16]發現槲皮素可下調Pi3k、p-Akt及Bcl-2表達，上調Bax表達，通過PI3K-Akt信號通路誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡。Luo等[17]發現槲皮素納米顆粒通過抑制JAK2誘導宮頸癌細胞凋亡和自噬，抑制STAT3/5和PI3K/Akt信號通路，調控細胞周期蛋白D1和mTOR，抑制宮頸癌細胞增殖。腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是一個高度復雜的綜合動態系統，由腫瘤細胞、基質細胞和細胞外基質組成，具有低氧、營養缺乏、酸中毒、慢性炎癥、免疫抑制，以及多種細胞因子產生等生物學特征，在抗癌藥物耐藥以及腫瘤復發、轉移等方面具有重要作用。乏氧誘導因子(hypoxia- inducible factors，HIFs)、血管內皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)等共同參與了腫瘤微環境形成及腫瘤血管生成。本研究發現槲皮素靶點還能顯著富集在的HIF-1信號通路和VEGF信號通路上，實驗[18]證實槲皮素可以靶向VEGFR-2，調控AKT/mTOR等下游信號通路，抑制腫瘤生長和血管形成。Hu等[19]則發現磷酸槲皮素可顯著抑制活化成纖維細胞中wnt16的表達，誘導TME重構，發揮協同抗癌作用。

總之，本研究借助生物信息學相關技術與方法，系統研究了槲皮素抗宮頸癌靶點、生物過程、信號通路等，全面揭示了槲皮素多靶點、多通路、多機制抗宮頸癌的藥理學作用。