沙果渣膳食纖維超高壓處理條件優化及其微觀結構表征

朱 丹，朱立斌，牛廣財,3*，苗欣月，魏文毅,3，王 坤,3

1黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院；2黑龍江八一農墾大學食品學院；3黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，大慶 163319

膳食纖維是指植物類食品中不被人體胃腸道消化酶消化，但能被人體胃腸道系統內定殖的部分微生物酵解或利用的，特指非淀粉性多糖類和木質素的總稱。根據其溶解性的不同，一般分為可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)和不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)[1]。目前，制備膳食纖維食品的主要來源是各種農作物加工后的廢棄物，如大豆皮渣、燕麥麩皮、米糠、麥麩和黑豆皮等[2,3]，膳食纖維中SDF含量是影響膳食纖維生理功能的重要因素。美國學者Richard.E和Donald.J建議平衡的DF組成要求SDF占TDF總量的10%以上，而一般的膳食纖維不具備較好的加工特性、生理活性和保健功能，其可溶性纖維比例都很低，只有3%～4%。高品質膳食纖維中可溶性成分含量應該達到10%以上。因此，采用不同的方法對膳食纖維進行改性，使其SDF比例提高，具有更高的持水性、膨脹力和更強的吸附作用等成為研究的熱點。常用的膳食纖維改性方法有化學方法、生物技術方法、物理方法以及多種方法組合等。化學法是利用酸堿等化學試劑處理膳食纖維，改變膳食纖維結構，使纖維類大分子轉化為非消化性多糖，該方法雖方便快捷，但反應復雜、時間長、污染環境，已逐漸被其他方法所取代[4]；生物改性技術采用的方法有酶法和發酵法[5]，目前應用的膳食纖維改性的酶主要有木聚糖酶、纖維素酶等。生物改性條件溫和，無化學溶劑污染，改性后產品中可溶性成分增多，持水力、膨脹力和吸附性等生物活性功能提高，但是，生物技術方法成本較高，仍需進一步優化工藝；物理方法是使纖維物質發生破碎、膨化，進而改變其理化性質，該方法操作簡單，可用于開發新型功能性產品。主要有螺桿擠壓技術、蒸汽爆破技術、超高壓技術(ultra high pressure，UHP)、超聲波處理(ultrasonic wave，UW)和超微粉碎技術等[6,7]。其中，超高壓技術處理是一個純物理過程，是將物料用超高壓(一般是100～1000 MPa)處理，物料在液體介質中體積被壓縮，超高壓產生的極高的靜壓能使氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價鍵發生變化，從而使大分子物質改性或變性[3]。

沙果(MalusasiaticaNakai)為薔薇科植物林檎的果實，是東北地區夏秋季節大量上市的地產水果。在企業生產濃縮汁時產生了大量的廢渣，引起了嚴重的環境污染與資源的浪費，已成為困擾濃縮汁生產企業的一大難題。目前，尚未見到有關超高壓處理對沙果渣膳食纖維影響的研究。因此，本研究以沙果渣為原料，研究超高壓處理對沙果渣中SDF/TDF的影響，并借助掃描電鏡和紅外光譜等方法分別對其微觀結構與官能團進行表征，以期為沙果渣高品質膳食纖維的生產及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙果渣由黑龍江省大慶森陽果蔬食品科技有限公司提供，60 ℃烘干，粉碎；食用級大豆油，黑龍江九三油脂有限公司；無水乙醇、丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、無水乙酸鈉等均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

FW80型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；101-2AB電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；AR2140電子天平，奧豪斯國際貿易(上海)有限公司；HPP600MPa超高壓設備，包頭科發高壓科技有限公司；電子掃描電鏡，JSM-6490LV，日本電子株式會社；Spectrum 2000型傅立葉紅外光譜分析儀，美國PE公司；TDL-S-A離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 沙果渣膳食纖維(DF)的制備

將干沙果渣粉碎后過60目篩，以1∶15料液比加入80%乙醇，對樣品浸提2次，離心分離后，繼續用丙酮洗滌沉淀，揮干后將沉淀在干燥箱中低溫干燥。然后按一定料液比，用水將預處理后的沙果渣粉調成懸濁液，裝入超高壓包裝袋，調整設備的壓力和處理時間，進行超高壓實驗。處理結束后進行抽濾，濾渣經干燥得到IDF；收集濾液，于60 ℃下減壓濃縮后，加入4倍體積無水乙醇密閉，靜置過夜，再次抽濾，將抽濾后的沉淀物干燥得到SDF[8]。

1.3.2 單因素實驗

超高壓處理沙果渣在室溫下進行，調節料水比后，裝入超高壓包裝袋，設置設備的壓力和處理時間，進行超高壓處理實驗。

1.3.2.1 壓力對SDF/TDF的影響

將處理后的沙果渣以料液比1∶15(g/mL)浸潤，常溫下放置2 h，分別在100、200、300、400、500 MPa壓力下處理15 min，干燥后測定SDF/TDF。

1.3.2.2 料液比對SDF/TDF的影響

將處理后的沙果渣分別以不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)浸潤，常溫下放置2 h，然后在300 MPa壓力下處理10 min，干燥后測定SDF/TDF。

1.3.2.3 處理時間對SDF/TDF的影響

將處理后的沙果渣以料液比1∶20(g/mL)浸潤，常溫下放置2 h，在300 MPa壓力下分別處理5、10、15、20、25 min，干燥后測定SDF/TDF。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，采用中心組合Box-Behnken設計方案，以SDF/TDF為響應值(Y值/%)，研究料液比、壓力和時間各因素對沙果渣膳食纖維中SDF/TDF的影響，因素水平編碼見表1。

1.3.4 膳食纖維理化性質測定

1.3.4.1 膳食纖維含量測定

不溶性膳食纖維(IDF)和可溶性膳食纖維(SDF)的測定：參照AACC32-06的方法測定。SDF占TDF的比例按如下公式計算：

SDF/TDF=SDF/(SDF+IDF)×100%

1.3.4.2 持水力(WHC)的測定

參照Esposito等[9]方法，準確稱取沙果膳食纖維干樣(m1)1.0 g置于50 ml離心管(m0)中，加入10 mL蒸餾水浸泡，搖勻，室溫下靜置1 h，于5000 rpm離心20 min，棄去上清液，離心管殘留水分用濾紙吸干后，稱量離心管與樣品質量(m2)，計算WHC。

WHC(g/g)=(m2-m0-m1)/m1

式中，m1—樣品干樣質量(g)；m2為離心管與吸水樣品的總質量(g)；m0為離心管質量(g)。

1.3.4.3 持油力(OHC)的測定

參考Wang等[10]方法略有改動，準確稱取沙果膳食纖維干樣(m1)1.0 g置于50 ml離心管(m0)中，加入10 mL大豆油搖勻，室溫下靜置1 h，于5000 rpm離心20 min，小心棄去上層油后，稱量離心管與樣品質量(m2)。計算OHC。

OHC(g/g)=(m2-m0-m1)/m1

式中，m1—樣品干樣質量(g)；m2為離心管與吸附油脂樣品的總質量(g)；m0為離心管質量(g)。

1.3.4.4 膨脹力(SC)測定

參考Robertson等[11]方法略有改動，準確稱取沙果膳食纖維干樣0.5 g置25 mL刻度試管中，讀取樣品干樣體積(v0)，加入20 mL蒸餾水，震蕩搖勻，于室溫下放置24 h，測定其膨脹體積后體積(v1)，計算SC。

SC(mL/g)=(v1-v0)/ m

式中，v1為樣品膨脹后體積(mL)；v0為樣品干樣體積(mL)；m為樣品干樣質量(g)。

1.3.5 膳食纖維功能特性的測定

1.3.5.1 膳食纖維陽離子交換能力的測定

參考Zhang[12]方法，稱取0.5 g膳食纖維干樣，加0.1 mol/L的鹽酸20 mL，搖勻，室溫放置過夜，濾紙過濾后用蒸餾水反復清洗除去多余的鹽酸。處理后的樣品中加入5%NaCl溶液100 mL，磁力攪拌30 min，以0.5%的酚酞乙醇溶液為指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定，用蒸餾水代替HCl做空白實驗，重復測定3次。計算陽離子交換能力(cation exchanging capacity，CEC)。

CEC=(V0-V1)×0.1/m

式中，V0為樣品消耗的NaOH體積(mL)；V1為空白消耗的NaOH體積(mL)；m為樣品干樣質量(g)；0.1為NaOH濃度(mol/L)。

1.3.5.2 膳食纖維對膽固醇吸附量的測定

參考Huang[13]方法，取市售鮮雞蛋去蛋清留蛋黃，加入9倍質量的蒸餾水充分攪打成均勻乳液。分別稱取1.0 g膳食纖維樣品于100 mL的錐形瓶中，向每個錐形瓶中加入25.0 g稀釋的蛋黃液并攪拌均勻，在37 ℃下振蕩2 h，于5 000 rpm轉速下離心20 min，吸取上清液，采用鄰苯二甲醛法測定膽固醇含量。計算膳食纖維對膽固醇吸附量。

膳食纖維對膽固醇的吸附量(mg/g)=

(W2-W1)/W

式中，W為膳食纖維干樣質量(g)；W2為吸附前蛋黃液中膽固醇含量(mg)；W1為吸附后上清液中膽固醇含量(mg)。

1.3.5.3 膳食纖維吸附葡萄糖能力的測定

參考Huang[13]方法，稱取1.0 g膳食纖維樣品于250 mL的錐形瓶中，加入100 mL質量濃度為100 μg/mL的葡萄糖溶液，混勻后在37 ℃下振蕩6 h，5 000 rpm轉速下離心20 min，吸取上清液，采用蒽酮法測定上清液中葡萄糖含量。

膳食纖維對葡萄糖的吸附量(mg/g)=

(C0-C1)×V/M

式中，M為膳食纖維干樣質量(g)；C0為吸附前葡萄糖質量濃度(μg/mL)；C1為吸附后上清液中葡萄糖質量濃度(μg/mL)；V為吸附液體積(mL)。

1.3.6 沙果渣膳食纖維微觀結構表征

1.3.6.1 掃描電鏡

將超高壓處理前后的沙果渣膳食纖維樣品干燥至恒重，取適量進行粘臺，采用離子濺射方法將其表面鍍金，在加速電壓12.5 kV條件下對已制備好的樣品進行掃描電鏡觀察。

1.3.6.2 傅里葉紅外光譜掃描

稱取超高壓處理前后的沙果渣膳食纖維樣品各2.00 mg于瑪瑙研缽中，分別與200 mg KBr粉末充分混合并研磨均勻壓片，立即進行紅外光譜掃描，掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2007作圖，響應面試驗的設計和分析用Design-Expert 8.0軟件進行處理。利用SPSS 17.0軟件進行兩個樣本獨立T檢驗并對實驗數據進行處理和分析，結果以平均值±標準差的形式表示。數據多重比較采用Duncan 法分析0.05水平上均值的顯著差異。

2 結果與分析

2.1 壓力對沙果渣SDF/TDF的影響

由圖1表明，增加壓力改變了可溶性膳食纖維在沙果渣總膳食纖維中的含量。但是，在作用壓力從100 MPa增加至200 MPa時，SDF/TDF增加幅度較大，沙果渣中可溶性膳食纖維的含量提高較快；在由200 MPa增加至300 MPa時增加幅度變緩，這可能是結構較致密的大分子組分如纖維素，半纖維素，木質素等的糖苷鍵在該壓力下發生斷裂，使SDF/TDF增加；當壓力超過300 MPa時，SDF/TDF呈下降趨勢。因此，從實際情況考慮，300 MPa為適宜采用的壓力。

圖1 壓力對SDF/TDF的影響Fig.1 Effect of pressure on SDF/TDF of M.asiatica residue

2.2 料液比對沙果渣SDF/TDF的影響

由圖2可知，當料液比為1∶20時，SDF/TDF達到最大，之后呈下降趨勢。這是因為料液比在1∶20時，由于300 MPa超高壓處理產生的空穴作用、碰撞作用及剪切作用對物料的作用較強，大分子變為小分子，致密結構變得疏松，使可溶性成分被釋放出來。再繼續增加料液比時，SDF/TDF呈下降趨勢，說明料液比過大會導致單位體積底物含量偏低。

圖2 料液比對沙果渣SDF/TDF的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on SDF/TDF of M.asiatica residue

2.3 處理時間對SDF/TDF的影響

由圖3可知，隨著超高壓處理時間的延長，SDF/TDF呈現上升趨勢。在15 min的保壓條件下，SDF/TDF達到最大值21.67%。之后隨著時間的延長則開始下降，可能是由于時間過長，SDF組分中的部分果膠在水溶液中被氫離子分解而降低SDF的得率[14]。表明一定時間的超高壓處理，能夠在一定程度上使沙果渣總膳食纖維中SDF增加，在料液比1∶20的情況下，300 MPa壓力下處理15 min時較為合適。

圖3 處理時間對SDF/TDF的影響Fig.3 Effect of processing time on SDF/TDF of M.asiatica residue

2.4 響應面試驗結果分析

應用Design-Expert 8.0軟件，對表2中試驗數

據進行二次多項擬合，得到的回歸方程為：

Y=21.66-0.058A+0.080B-0.020C+0.010AB+0.83AC+0.25BC-0.34A2-0.68B2-1.32C2。

表2 響應面試驗結果與分析

表3 二次多項模型方差分析表

續表3(Continud Tab.3)

方差來源Source平方和Sum of squares自由度df均方Mean squareF值F valueP值P value顯著性SignificanceBC0.2510.256.640.049 6*A20.4410.4411.570.019 2*B21.7211.7245.830.001 1**C26.4716.47171.86< 0.000 1**殘差Residual0.1950.038失擬項Lack of fit0.1730.0576.600.134 5純誤差Pure error0.01728.633E-003總和Total11.1814

注：*表示P<0.05差異顯著；**P<0.01差異極顯著。

Note:*shows significant differences (P<0.05);**means extremely significant differences (P<0.01).

同時，利用Design Expert 軟件作出兩因素交互作用的響應面圖及其等高線圖，結果見圖4。響應面的曲面開口向下，隨著每個因素變量的增加，響應值也增加，當響應值達到最大值后，隨著各因素的繼續增加，響應值則逐漸降低，說明最佳點在考察的范圍內。等高線的形狀可反映交互效益的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖4也可看出，AB交互作用不顯著，AC、BC間交互作用顯著。

圖4 料液比、壓力、時間交互作用對SDF/TDF值影響的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between solid-liquid ratio,pressure and processing time on SDF/TDF

根據Design-Expert 8.0軟件優化分析，在料液比1∶19.30 g/mL，壓力304.93 MPa，時間14.76 min條件下，模型預測沙果渣膳食纖維中SDF/TDF值21.66%。為驗證響模型預測結果的可靠性，結合實際操作的方便性，在料液比1∶19.30 g/mL，壓力300 MPa，時間15 min條件下，進行3次重復驗證試驗，測得的SDF/TDF值分別為：21.76%、21.70%和21.67%，平均值為21.71%。與理論預測值相比，誤差為0.23%，即與預測值相符。

2.5 超高壓處理前后沙果渣膳食纖維理化性質的變化

沙果渣膳食纖維超高壓處理前后理化性質的變化見表4。由表4可知，經過超高壓處理后，沙果渣膳食纖維的持水力、持油力和膨脹力均有了顯著的提高(P<0.05)。其中，持水力由6.67 g/g升至7.81 g/g，提高了17.09%；持油力由7.34 g/g升至8.03 g/g，提高了9.40%；膨脹力由6.34 mL/g升至7.20 mL/g，提高了13.56%。這可能與超高壓處理后樣品的內部結構發生變化有關。

表4 處理前后理化性質的變化

2.6 超高壓處理前后沙果渣膳食纖維功能特性的變化

膳食纖維結構中含有弱酸性的羧基、羥基等側鏈基團，可以與陽離子可逆交換，類似陽離子樹脂的作用。由表5可知，經過超高壓處理后，沙果渣膳食纖維的陽離子交換能力為0.78 mmol/g，顯著高于處理前的樣品(P<0.05)；膳食纖維還具有吸附或包埋人體內膽固醇的能力，可降低血漿膽固醇水平，減少機體對膽固醇的吸收。超高壓處理后沙果渣膳食纖維對膽固醇吸附的吸附量為14.31 mg/g，顯著高于處理前的樣品(P<0.05)，可能是超高壓處理后沙果渣膳食纖維中可溶性膳食纖維提高所致；膳食纖維也具有抑制葡萄糖擴散的功效，可降低血液中葡萄糖的含量，有效控制血糖指數[15]。超高壓處理的沙果渣膳食纖維吸附葡萄糖能力顯著高于處理前的樣品(P<0.05)，表明膳食纖維的對葡萄糖吸收能力與其可溶性膳食纖維的含量及物理結構有關的結果相一致。主要是由于可溶性膳食纖維與水接觸后產生的凝膠狀物體將葡萄糖分子包裹其中，并且膳食纖維疏松的網狀結構也會減緩葡萄糖分子在食品體系中的擴散速率[16]。

表5 處理前后功能特性的變化

2.7 超高壓處理前后沙果渣膳食纖維的微觀結構分析

沙果渣膳食纖維超高壓處理前后其結構的掃描電鏡圖見圖5。由圖5可知，經超高壓處理后的沙果渣膳食纖維樣品與未經處理樣品相比，微粒呈現不規則形狀，表面孔隙較多，組織結構變得更加疏松多孔，溝壑、網狀及層狀結構增多。這與超高壓處理后沙果渣膳食纖維的持水力、持油力、膨脹力增加的情況相符合。而未處理樣品表現為微粒大小不一，表面光滑，結構緊湊，主要呈不規則形狀的碎石狀，結構較致密的排列在一起。這是由于超高壓處理過程中產生了極高的靜壓及伴隨的氣穴、摩擦、沖擊等壓力，不但能影響細胞的形態，還能使形成生物大分子立體結構的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價鍵發生變化，這些結構的變化對膳食纖維的理化特性發揮著至關重要的作用[17]。

圖5 超高壓處理前(A)和處理后(B)沙果渣膳食纖維的SEM圖(放大300倍)Fig.5 SEM graph of dietary fiber from M.asiatica residue of (A) before treatment,(B) after treatment by UHP(×300)

2.8 超高壓處理前后膳食纖維的紅外光譜分析

沙果渣膳食纖維超高壓處理前后樣品的紅外光譜圖見圖6。由圖6可以看出，在3 425 cm-1附近出現較大的寬吸收峰，這是由O—H羥基的伸縮振動引起的，說明沙果渣膳食纖維可能存在著較多的羥基及結合水分子[18]。2 921.49和2 920.92 cm-1處的吸收峰為C—H的伸縮振動峰[19]；1 734.61和1 735.81 cm-1處的吸收峰是半纖維素的特征吸收峰，為木聚糖C=O伸縮振動引起的[20]；在1 633.43和1 631.44 cm-1處的吸收峰是由C=O伸縮振動引起的，說明沙果渣膳食纖維中可能存在糖醛酸[21]；897.34 cm-1處的吸收峰表明沙果渣膳食纖維單糖含有β型吡喃糖C—H的彎曲振動[22]。

圖6 超高壓處理前(A)和處理后(B)沙果渣膳食纖維的紅外光譜圖Fig.6 The infrared spectra of dietary fiber from M.asiatica residue of (A) before treatment,(B) after treatment by UHP

圖6的紅外光譜分析表明，沙果渣纖維中有纖維素、半纖維素和木質素的特征吸收峰。在波長為3 425.12、2 920.92、1 631.44和1 059.02 cm-1處有較大的區別，1 631.44 cm-1為木質素分子結構附近的吸收峰，1 059.02 cm-1(C=O伸縮振動)處的吸收峰為纖維素的特征吸收峰。由于分子間氫鍵作用力的破壞，超高壓處理后樣品的譜帶強度減小并變窄，這可能是因為超高壓處理使部分木質素和纖維素轉變為可溶性膳食纖維，而導致SDF含量增加所致。

3 結論

本試驗利用Design Expert軟件，采用響應面法建立了超高壓處理沙果渣膳食纖維對SDF/TDF的數學模型，擬合性好。同時，優化了超高壓處理的料液比、壓力和時間等條件，最優條件為處理壓力300 MPa，時間15 min，料液比1∶19.30(g/mL)，該條件下沙果渣膳食纖維的可溶性膳食纖維含量、持水力、持油力、膨脹力、陽離子交換能力、對膽固醇吸附量、吸附葡萄糖能力分別為21.71%、7.81 g/g、8.03 g/

g、7.20 mL/g、0.78 mmol/g、14.31 mg/g和8.20 mg/g，其理化性質均優于未經超高壓處理的沙果渣膳食纖維。經過掃描電鏡觀察和紅外光譜分析超高壓處理后的沙果渣膳食纖維樣品，呈現不規則形狀，表面孔隙增多，組織結構變得更加疏松多孔，溝壑、網狀及層狀結構增多，與處理后其理化性質的改善完全吻合。