均質剪切輔助響應面法提取扛板歸總黃酮及其抗氧化性能研究

黃國霞，李橋換，閻柳娟

1廣西科技大學 生物與化學工程學院，柳州 545006；2柳州市婦幼保健院，柳州 545000；3廣西科技大學 廣西高校糖資源加工重點實驗室；4廣西糖資源綠色加工重點實驗室(廣西科技大學)，柳州 545006

杠板歸(PolygonumperfoliatumL.)為蓼科屬貫葉蓼植物，為多年生蔓性草本，主要分布在我國南方地區，是清熱解毒、散瘀消腫、去濕利尿之良藥，民間常用來治療蛇毒、濕疹、黃疸、乳腺炎、百日咳等[1,2]。Cai等[3]實驗還表明扛板歸醇提物對小鼠肝損傷有一定的修復作用。現代分離鑒定技術證明扛板歸中含有糖類、酚羧基類、蒽醌、黃酮類等多種化合物[4,5]，其中黃酮類有槲皮素、槲皮苷、異鼠李素、金絲桃苷等。研究表明，在酚羥基的作用下，黃酮能夠有效清除自由基，從而起到抗氧化作用[6-8]，以此提高人體的自我保護能力，預防和減少炎癥的產生及抑制正常細胞癌變[9]。

定子、轉子包埋于樣品中，在機械的帶動下，轉子的高速轉動能使兩者之間受到強烈的氣蝕作用、剪切效應和機械效應，從而使物料受到高速碰擊、液層摩擦、湍流等作用實現高速剪切效果。隨著工業制造領的創新和精密度的提高，使得高速剪切這項起初用于化妝品、食品、工業等方面粗放式乳化的技術得以有更廣泛的應用。而且該技術具有破碎力度大、用料少、時間短、操作簡便等優點，近年來，在中藥材有效成分如多糖、黃酮等的提取中有較多的應用[10-12]。冷凝回流技術是常用的中藥有效成分提取技術，液體受熱氣化，遇冷轉化為液體流回瓶中，在液態-氣態-液態反復過程中，使得內含物充分溶出。

扛板歸作為民間的優秀藥材，目前在現代化生產的中成藥中卻比較少見有應用，對扛板歸中黃酮提取的報道也較鮮見，未見有使用高剪切處理提取總黃酮的報道。本實驗采用高剪切-回流兩步法對扛板歸中總黃酮進行提取，在單因素的基礎上用響應面法對扛板歸中總黃酮提取工藝進行優化，研究了扛板歸總黃酮對三種常見自由基的清除能力，旨在為這味藥材的現代化生產提供依據，使我國傳統優良藥材得到更好的開發利用。

1 實驗方法及步驟

1.1 儀器設備

BME 100L高剪切混合乳化機(上海威宇機電有限公司)；DXF-20C/D中藥粉碎機(廣州大祥電子機械設備有限公司)；Cary 60紫外可見分光光度計(安捷倫科技)；Alpha 1-4 LD plus冷凍干燥機(德國 CHRIST)，鼓風干燥箱等。

1.2 材料與試劑

扛板歸摘取地上部分，洗凈，晾干，剪碎，于烘箱80 ℃干燥后粉碎，過80目篩，收集備用。

蘆丁標準品(國藥集團化學試劑公司)干燥至恒重后用無水乙醇配制成200 μg/mL的儲備液，用時稀釋至所需濃度；無水乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉等試劑均為分析純；試驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮標準曲線繪制

參考文獻[13]，量取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL蘆丁儲備液分別置于10 mL容量瓶，

用50%乙醇定容至10 mL。取10 mL比色管若干支，加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加0.3 mL 10% AlNO3，搖勻，靜置6 min；加4 mL 50% NaOH，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻,靜置15 min，以不加蘆丁的溶液作對照，在510 nm處測定吸光度A,重復三次。以濃度為橫坐標，A值為縱坐標繪制曲線并進行線性擬合，根據實驗結果，所繪方程為A=10.75C+0.001 25,相關系數R= 0.998 2,說明該模型線性關系較好，可用于分析。

1.3.2 黃酮的提取流程

如圖1 所示安裝好儀器，取扛板歸粉末適量，裝入高剪切乳化專用瓶中，加入適量乙醇，在合適的溫浴中進行多次間歇性剪切，加熱回流，收集提取液，旋轉蒸發至瓶內余少量液體，此為黃酮粗品，取出粗品，D101樹脂純化后冷凍真空干燥，即為總黃酮。

總黃酮提取率的計算公式：

A：為溶液稀釋倍數；C：為溶液的濃度；V：為溶液的體積；M：為提取原料的質量。

圖1 提取裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram for interaction

1.3.3 單因素實驗

高剪切可以破壞細胞壁結構使細胞內物質更容易流出，有助于內容物的提取[14]。所以在回流之前對材料進行高剪切處理。精密稱取1.00 g扛板歸粉末于高剪切專用三口圓底燒瓶中，用60 mL乙醇溶液分散，將圓底燒瓶浸入恒溫水浴中，感溫探頭插入圓底燒瓶內，開啟設備進行剪切。改變剪切處理次數和溫度，考察它們對提取率的影響。

前期實驗表明，提取溫度、乙醇濃度、提取時間和料液比對提取率的影響較大，故選取這四個因素進行單因素實驗。分別考察提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)、乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)，料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)對總黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應面實驗

結合單因素的結果，采用響應面法進一步優化，以提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度為自變量，按照Box—Behnken中心組合設計響應面優化方案，選取4因素3水平的組合(表1)。

表1 響應面試驗因素與水平

1.4 對自由基的清除能力

參考文獻[15,16],根據實際有所修改。對·OH清除能力的實驗方法：精密稱取扛板歸總黃酮適量，用50%乙醇配制成一系列濃度的待測液，取10 mL 比色管若干支，分別加入0.5 mL 7.5 mmol/L FeSO4、0.5 mL 0.2% H2O2溶液(空白組換成同體積超純水)，置于37 ℃恒溫水浴鍋中，30 分鐘后取出，加入1.0 mL待測液(對照組和空白組換成同體積超純水),然后加入0.9 mL 5 mmol/L鄰二氮菲，定容至刻度，37 ℃水浴15分鐘后測吸光度值A536nm(以超純水為參比)，每個樣測三次，取平均值。同時取Vc適量，配成一系列濃度，同上步驟測其對·OH的清除能力。用以下公式計算清除率。

·OH清除率=](A樣品-A對照)/(A空白-A對照)]×100%

對DPPH·清除能力的實驗方法：精密稱取扛板歸總黃酮適量，用70%乙醇配制成梯度濃度的待測液，取10 mL 比色管若干支，分別依次加入1.0 mL待測液(空白組換成同體積70%乙醇)，2 mL 0.01 mmol/LDPPH乙醇溶液(本底組換成同體積70%乙醇)，搖勻，避光反應30 min后測吸光度值A517nm(以超純水為參比)，重復三次，取平均值。同時取Vc適量，配成一系列濃度，同上步驟測其對DPPH·的清除能力。用以下公式計算清除率。

DPPH·清除率=[1-(A樣品-A本底)/A空白]×100%

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 剪切次數和剪切溫度對黃酮提取率的影響

高速剪切能夠使植物顆粒組織在定、轉子狹窄的間隙中受到強烈的機械剪切、離心擠壓、撞擊撕裂和踹流等作用，在較短時間內實現破壁效果，是中藥粉碎機的一個重要后續補充。高剪切優化提取結果如圖2。為了防止電機過熱受到損壞，只能采用間歇式處理，每次處理時間約為30秒，所以需要多次剪切才能使黃酮溶出更徹底，如圖2所示，剪切7次效果最佳，此時扛板歸中黃酮的提取達到最高值(8.37%)。剪切處理時的溫度對黃酮提取率也有一定影響，當剪切處理溫度為50 ℃時,黃酮提取率達到最大,說明該溫度下最有利于黃酮的溶出。溫度過低時,分子運動不夠劇烈,溶液對植物組織的浸潤作用也未能達到最大化；溫度過高時，乙醇容易氣化于液面之上甚至部分揮發至容器外，使得溶液內的濃度降低，另一方面，過高的溫度會使黃酮化合物發生立體異構和縮合反應，不利于產物的提取，而且較高溫度下蛋白、糖類、淀粉等雜質的溶解度會增加，也會阻礙目標產物的提取。與未剪切處理的樣品相比，經過剪切處理的實驗組的提取率有所提高，表明在回流之前加入剪切步驟是提高提取率的有效方法。

圖2 高剪切處理對提取率的影響Fig.2 Effect of high shear treatment on extraction rate注：a：P=0.048，差異顯著；b：P=0.005 3，差異極顯著。Note:a:P=0.048,significant;b:P=0.005 3,very significant.

2.1.2 回流溫度對黃酮提取率的影響

由圖3可知隨著溫度的升高，提取率逐漸升高，在70～80 ℃時提取率急劇升高，80 ℃時達到最高值。溫度升高可加快分子運動，利于提取。但是過高的溫度則會使黃酮趨于分解，并且使糖類、蛋白、淀粉等雜質溶出，導致產率降低。故80 ℃應為較適合的提取溫度。

圖3 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction yield of total flavonoids注：P=0.012，差異顯著。Note:P=0.012,significant.

2.1.3 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

扛板歸中含有多種黃酮類物質，故提取出來的是多種黃酮的混合物，又因原生藥材的獨特性，每種藥材適合的提取濃度不盡相同。在本實驗中，由圖4可知，乙醇濃度為60%時，黃酮提取率最大，根據相似相溶理論，說明此濃度下乙醇的極性可能和黃酮混合物的極性較為相近，故溶出率高。

2.1.4 回流時間對黃酮提取率的影響

充足的時間能使溶劑更充分的滲入到藥材內部，利于黃酮的溶出。圖5的結果表明，在1小時內，隨著提取時間的延長，提取率緩慢上升，1～2小時之間急劇上升，2小時后又趨于平緩，為了節約時間成本，本實驗采用2小時作為回流時間。

圖4 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids注：P=0.000 000 62，差異極顯著。Note:P=0.000 000 62,very significant.

圖5提取時間對扛板歸黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction yield of total flavonoids注：P=0.004 8，差異極顯著。Note:P=0.004 8,very significant.

2.1.5 不同料液比對黃酮提取率的影響

如圖6所示，加大提取液的量可以提高黃酮提取率，在1∶60之前提高幅度較大，之后則上升趨于平緩。加大溶劑用量能使物料的可擴散空間增加，減少聚集體的產生，物料與溶劑的有效接觸面積增大，對植物組織壁材的浸潤破裂效果則更好，能使更多的黃酮溶出。但是使用大量的溶劑會提高成本，也使后續的濃縮時間增加，綜合時間和經濟成本，本實驗選取1∶60作為溶劑對扛板歸中黃酮進行提取。

圖6 料液比對黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of total flavonoids注：P=0.000 29，差異極顯著。Note:P=0.000 29,very significant.

2.2 響應面結果

2.2.1 響應面實驗結果

根據單因素實驗結果， 選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間四個因素，利用Box-Behnken軟件進行實驗設計，研究各因素對扛板歸中黃酮提取率的影響。實驗設計分組及結果見表2，模型的方差分析結果見表3。

由表2可知，一次項中C、D項為顯著；交互項中BD、CD項差異顯著；二次項中B2為顯著，其余項均為極顯著。各項的F值的大小反映出相對提取率的大小[17]，由此可以得出單因素中影響提取率主次為：C(溫度)>D(料液比)>A(濃度)>B(時間)。失擬誤差=0.015 1<0.05，差異顯著。模型的回歸系數R2為0.965。綜合以上分析，該模型擬合程度較好，誤差較小，可以用來分析和預測不同提取工藝條件下扛板歸總黃酮提取率的最佳理論值。

由表3的方差分析可知，該實驗數據所建立的模型的F值為3.25，P值為0.0125<0.05,該模型顯著，此方程可以指導扛板歸的黃酮提取。該模型擬合出的回歸方程為：

Y=8.20+0.039A-0.034B+0.11C-0.069D+0.015AB+0.032AC-0.0AD+0.039BC+0.091BD-0.17CD-0.53A2-0.28B2-0.29C2-0.37D2

方程式中A、B、C、D分別為濃度、時間、溫度、料液比。

表2 Box-behnken實驗的設計及結果

續表2 (Continued Tab.2)

序號No.A提取時間Time(h)B試驗溫度Temperature(℃)C乙醇濃度Ethanol concentration(%)D料液比Ratio of material to liquid提取率Extraction yield(%)152.5070.0050.0060.007.311162.0080.0050.0060.008.245172.580.0060.0060.007.354182.0090.0050.0070.007.211192.0080.0050.0060.008.304202.5070.0050.0050.007.643212.0070.0060.0060.007.863222.0080.0060.0050.007.740231.5080.0050.0050.007.331242.0070.0050.0070.007.563251.5090.0050.0060.007.351262.0080.0050.0060.008.122271.5080.0050.0070.007.325281.5080.0040.0060.007.190292.0080.0060.0070.007.322

表3 回歸模型方差分析

注：**P<0.01極顯著；*P<0.05顯著。

Note:**P<0.01 very significant;*P<0.05 significant.

2.2.2 響應面交互作用分析結果

三維響應面圖是由各因素兩兩所構成的圖，其他實驗因素不變時，交互因素對提取率的影響，三維圖及等高線圖可用于分析各因素對黃酮提取率的影響。如圖7所示，兩兩因素的交互中均存在極值，極值對應的點接近橢圓的中心。時間與溫度，時間與濃度，物料比與濃度這三組交互作用形成的等高線均為橢圓形，橢圓率較大，說明它們兩兩之間的交互作用較為明顯。而時間與料液比、溫度與濃度、溫度與料液比這三組交互作用對應的等高線橢圓度較小，說明這三組交互作用相對較弱。

圖7 不同因素交互作用對黃酮提取率影響的響應面曲線和等高線Fig.7 Reponse surface plots and contour line of effect of interaction between different factors on the extraction yield of total flavonoids

2.2.3 扛板歸中黃酮提取的最佳條件驗證性試驗

經響應面優化，最佳提取工藝為：提取溫度79.3 ℃，乙醇濃度52.3%，料液比1∶58.3，提取時間2.0小時。根據所擬合的最佳條件進行驗證試驗，平行三次，取平均值，結果為8.2%，與預測值(8.3%)很接近，說明該響應面法優化的條件可信，此模型準確可信，重現性良好。

2.3 總黃酮體外抗氧化能力試驗結果

圖8 總黃酮和Vc對自由基的清除能力Fig.8 Scavenging Ability of Total Flavonoids and Vc to Free Radicals

圖9 總黃酮對自由基清除率與Vc對自由基清除率的比值Fig.9 Ratio of scavenging to free radicals of total flavonoids and scavenging to free radicals of Vc

3 結論與展望