雙氫青蒿素對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的影響及其可能機制

梁春娜，羅志文，鄭曄輝，陳志煌 （.廣東省開平市中心醫(yī)院，廣東開平 59300；.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 5030；3.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東廣州 50000）

糖尿病腎病是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一[1-2]，在世界范圍內(nèi)，糖尿病腎病已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一[3]。已有研究表明，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，高血糖可通過激活TGF-β1/Samd通路，導(dǎo)致細胞外間質(zhì)的沉積，進而介導(dǎo)腎臟纖維化[4]，使患者腎功能進一步下降，最終走向腎衰竭[5-6]，就目前而言，仍未有良好的防治手段。青蒿素是我國中醫(yī)藥學(xué)工作者從草本植物黃花蒿中提取的活性成分，有良好的抗瘧和廣譜抗寄生蟲的作用，同時還具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗炎癥、抗纖維化的作用[7-9]；亦有研究證明青蒿素類藥物對腎臟有保護作用，但具體機制仍需進一步探討[10]。本研究通過觀察雙氫青蒿素對糖尿病腎病大鼠腎功能的保護作用及其對腎臟纖維化的影響，探究其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級8周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要實驗藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ) ：美國Sigma公司；雙氫青蒿素：南京廣潤生物制品有限公司；大鼠尿微量白蛋白ELISA試劑盒：南京建成生物科技有限公司；大鼠血肌酐ELISA試劑盒：南京建成生物科技有限公司；大鼠血尿素氮ELISA試劑盒：南京建成生物科技有限公司；蛋白酶磷酸酶抑制劑：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；組織蛋白提取試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；彩色預(yù)染蛋白Marker：武漢博士德生物工程有限公司；蛋白封閉緩沖液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠TGF-β1抗體、兔抗大鼠E-Cadherin抗體、兔抗大鼠Samd 3抗體、兔抗大鼠P-Samd 3抗體：美國CST公司；兔抗大鼠Fibronectin抗體：美國Millipore公司；兔抗大鼠GAPDH抗體：武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔熒光二抗：美國Invitrogen公司。

1.1.3 主要實驗儀器 電子天平：德國Sartorius公司；超低溫冰箱(－80℃)：美國Thermo公司；低溫離心機：美國Thermo公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀：美國Bio-Rad公司；多功能全自動酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析儀：美國Odyssey公司。

1.2 構(gòu)建動物模型

從60只正常SPF級雄性SD大鼠中隨機抽取10只作為正常對照組，剩余50只使用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法構(gòu)建糖尿病大鼠模型。具體方法為：禁食12 h后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素55 μg/g(體質(zhì)量)。1周后，取大鼠尾靜脈血液，通過血糖儀測定血糖，連續(xù)3次隨機血糖＞16.7 mmol /L 并且有多飲多食多尿大鼠選定為糖尿病模型。糖尿病造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，檢測尿微量白蛋白≥30 mg /L即為糖尿病腎病模型。50只大鼠中，有47只造模成功。

1.3 方法

將成功建模的糖尿病腎病大鼠(n=47)隨機分為模型對照組(n=11)、低劑量組(n=12)、中劑量組(n=12)、高劑量組(n=12)。低、中、高劑量組分別給予雙氫青蒿素10、20、40 g/(kg·d)灌胃。模型對照組給予等體積生理鹽水灌胃。所有組均治療8周。

1.4 觀察指標(biāo)

治療前各組大鼠禁食12 h，測體質(zhì)量、24 h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮。分別于雙氫青蒿素治療2、4、8周后，各組大鼠禁食12 h，測體質(zhì)量、24 h尿微量白蛋白、血肌酐、尿素氮。8周末處死大鼠，提取其腎臟皮質(zhì)中的蛋白質(zhì)用于Western-blot檢測TGF-β1、 Samd 3、 P-Samd 3、 Fibronectin及 ECadherin相關(guān)蛋白的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在雙氫青蒿素治療8周后，糖尿病腎病模型大鼠最終存活41只，其中模型對照組10只，低劑量組11只，中劑量組10只，高劑量組10只。最終納入統(tǒng)計分析的共有大鼠51只。

2.1 雙氫青蒿素對大鼠體質(zhì)量的影響

使用雙氫青蒿素治療后，低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量低于正常對照組，但相較于模型對照組大鼠的體質(zhì)量明顯回升(P<0.05)。不同劑量治療組間大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 雙氫青蒿素對大鼠24 h尿微量白蛋白的影響

使用雙氫青蒿素治療后，低劑量組大鼠24 h尿微量白蛋白與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而中、高劑量組在治療4、8周后24 h尿微量白蛋白下降(P<0.05)。詳見表2。

表1 雙氫青蒿素對大鼠體質(zhì)量的影響 (±s，g)

表1 雙氫青蒿素對大鼠體質(zhì)量的影響 (±s，g)

與正常對照組比較：a P<0.05；與模型對照組比較：bP<0.05

images/BZ_32_226_445_1155_515.png正常對照組模型對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 11 10 10 441.1±52.2460.3±42.7487.1±35.5 353.2±31.8a 335.4±32.1a 313.2±34.9a 411.7±52.6b 427.1±38.7b 433.7±51.5ab 408.1±58.1ab 412.8±42.6ab 428.2±54.3ab 415.6±62.3b 429.1±53.2b 432.2±48.1ab

2.3 雙氫青蒿素對大鼠腎功能的影響

使用雙氫青蒿素治療后，低、中、高劑量組大鼠的血肌酐、尿素氮較模型組明顯下降，高劑量組血肌酐、尿素氮下降更為顯著，但仍明顯高于正常對照組(P<0.05)。詳見表3。

表2 雙氫青蒿素對大鼠24h尿微量白蛋白的影響(±s，mg/L)

表2 雙氫青蒿素對大鼠24h尿微量白蛋白的影響(±s，mg/L)

與正常對照組比較：a P<0.05；與模型對照組比較：bP<0.05

images/BZ_32_227_1436_1157_1507.png正常對照組模型對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 11 10 10 7.3±5.76.9±4.38.1±5.6 103.2±21.8a 131.1±28.4a 113.5±20.2a 101.5±22.3a 118.4±29.7a 108.3±21.1a 98.2±23.8a 78.0±11.9ab 71.5±10.7ab 100.3±24.7a 79.1±10.4ab 74.2±11.4ab

2.4 雙氫青蒿素對大鼠腎臟中蛋白表達的影響

在雙氫青蒿素治療8周后，模型對照組大鼠腎臟中的TGF-β1、Samd 3、P-Samd 3、Fibronectin蛋白表達明顯高于正常對照組，而E-Cadherin表達則明顯降低(P<0.05)。低、中、高劑量組與模型對照組比較，F(xiàn)ibronectin和TGF-β1表達下降，E-Cadherin則明顯上升；中、高劑量組的Samd 3表達亦明顯降低，且其磷酸化水平明顯低于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

3 討論

隨著生活水平的提高，我國糖尿病的患病率在逐年上升[11]。糖尿病腎病是糖尿病最重要的血管慢性并發(fā)癥之一，在我國，約有30%～40%的糖尿病患者伴發(fā)有糖尿病腎病[12]。其主要病理變化最初為腎小球毛細血管基底膜增厚，系膜細胞增生，系膜基質(zhì)增多，進而出現(xiàn)纖維蛋白原沿基膜沉著，最終進展為腎小球硬化，宏觀上表現(xiàn)為腎臟的纖維化[13]，截自目前為止，未能找到針對性較強的治療方法[14]，其預(yù)后主要取決于疾病的早診斷與早治療[15]。

TGF-β是一個有著多種功能的生長因子超家族，在多種組織與器官中可促進纖維化[17]。TGF-β1的下游存在眾多信號通路，其中Samds通路在調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的上皮細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化及細胞外基質(zhì)積聚過程中處于十分重要的地位[18]。其中，Samd 3屬受體調(diào)節(jié)型Samds，它的磷酸化是Samd通路激活的最重要的標(biāo)志之一。細胞內(nèi)pSamd 3表達的多少即意味著該通路激活的程度[19]。在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1/Samd通路發(fā)揮著重要的作用[20]。但是否能通過藥物調(diào)控該通路抑制糖尿病腎病的病情進展，目前仍未有定論。

青蒿素是中藥青蒿的提取物，因其對瘧疾的治療而廣為人知[21]。已有研究證實，青蒿素及其衍生物除了抗瘧疾外，還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗纖維化的作用[22]。目前研究已證實青蒿素及其衍生物可在心臟、肝臟、肺臟、腎臟等多器官纖維化進程中發(fā)揮作用[23-25]。其衍生物SM934可用于治療小鼠狼瘡性腎炎[26]。在大鼠實驗性膜性腎病的研究中，SM934通過下調(diào)TGF-β1/ Samd信號通路改善大鼠腎臟損傷，減輕腎小管間質(zhì)纖維化[10]。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物之一，其可明顯延緩肝臟及肺臟的纖維化，發(fā)揮相應(yīng)的保護作用[28]。但其在腎臟中的作用尚不明確。故而，本研究旨在探討雙氫青蒿素在糖尿病腎病中可能發(fā)揮的的作用及其機制。

在本研究中，我們將健康的SD大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組，及低、中、高劑量組。雙氫青蒿素治療后，大鼠的體質(zhì)量回升，尿微量白蛋白減少，血肌酐及尿素氮明顯下降(P<0.05)，提示雙氫青蒿素具有一定的腎臟保護作用，且其保護作用的強弱可能與雙氫青蒿素的給藥劑量有關(guān)。為進一步探討其可能的機制，治療8周后，我們處死大鼠，取其腎臟組織并提取其中的蛋白用于檢測，發(fā)現(xiàn)纖維化相關(guān)蛋白Fibronectin在治療后的表達明顯降低，同時，作用于上皮細胞間相互連接的蛋白E-cadherin的表達量明顯回升至正常水平(P<0.05)，證明雙氫青蒿素治療的大鼠，其腎臟纖維化水平降低甚至可能得到逆轉(zhuǎn)。在對其作用靶點的探索中發(fā)現(xiàn)，加入雙氫青蒿素干預(yù)后，TGF-β1/Samd通路蛋白的表達發(fā)生了改變，主要表現(xiàn)為TGF-β1表達明顯下降，且與雙氫青蒿素劑量有關(guān)；同時，P-Samd 3表達亦明顯下降，提示該信號通路的活化得以抑制；且中、高劑量組的Samd 3表達亦受到影響，提示雙氫青蒿素可能影響了Samd通路蛋白的合成。此次研究結(jié)果表明，雙氫青蒿素可能通過抑制TGF-β1的表達，降低Samd通路蛋白的磷酸化，甚至可能同時抑制Samd通路蛋白的合成調(diào)節(jié)腎臟纖維化的進程。

表3 雙氫青蒿素對大鼠血肌酐、尿素氮的影響 (±s)

表3 雙氫青蒿素對大鼠血肌酐、尿素氮的影響 (±s)

與正常對照組比較：a P<0.05；與模型對照組比較：bP<0.05

images/BZ_32_207_2728_2273_2862.png正常對照組模型對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 11 10 10 30.3±5.230.9±4.330.1±5.66.1±1.26.2±1.06.1±1.0 79.1±9.1a 80.2±9.7a 79.9±8.6a 13.3±1.3a 13.6±1.2a 13.4±1.6a 77.5±11.3a 78.5±10.3a 77.5±11.3a 13.5±1.1a 12.9±1.4a 13.1±1.5a 76.2±13.8a 73.2±9.9a 71.2±10.1ab 12.2±1.8a 12.1±1.6a 12.0±1.1ab 73.3±9.7a 71.7±8.7ab 70.2±10.2ab 9.8±1.3ab 9.6±1.5ab 9.5±1.6ab

圖1 不同劑量雙氫青蒿素對大鼠腎臟中蛋白表達的影響

綜上所述，雙氫青蒿素可能通過TGF-β1/Samd通路抑制腎臟纖維化的進程，對腎臟有一定的保護作用，可改善糖尿病腎病大鼠的一般情況，為糖尿病腎病的藥物治療提供了新的理論和實踐依據(jù)。