大豆生育期E1、E2、E3和E4基因的研究與應用

呂世翔 王 萍 孫明明 夏正俊

(1.黑龍江省農業科學院 信息中心，哈爾濱 150086；2.中國科學院 東北地理與農業生態研究所/大豆分子設計育種重點實驗室，哈爾濱 150081)

在特定生態環境下獲得適應的成熟期是最大限度提高農作物產量的潛在前提條件[1]。作為一種典型短日作物，栽培大豆開花和成熟時間是其重要生態和農藝性狀。不同品種的光周期敏感性使其具有不同開花和成熟時間，種植于長日照高緯度地區的大豆品種需要具有光不敏感性，以保證其在霜凍前成熟。因而大豆光周期敏感性遺傳因素的研究對于大豆育種具有重要意義[2-3]。早在1927年，Owen[4]發現大豆中存在能夠控制其生育期的遺傳因子。1942年，王金陵[5]的《大豆之光期性》開啟中國大豆光周期研究，拉開對大豆生育期遺傳規律研究的序幕[6]。蓋鈞鎰等[7]在前人關于中國大豆栽培區域劃分的基礎上，將中國大豆品種生態區劃分為6大區，并在其中3個區內進一步分亞區。國內外學者相繼對不同生育期大豆品種比對研究，結果表明大豆生育期由多個基因同時調控，目前發現的控制大豆開花和成熟的基因有E1[8]、E2[9]、E3[10]、E4[11]、E5[12]、E6[13]、E7[14]、E8[15]、E9[16]、E10[17]和J[18]基因，其中E1、E3、E4和E7基因是決定光周期敏感性的主要基因[19]。隨著分子遺傳學和分子生物學的發展，E1[20]、E2[21]、E3[22]、E4[23]、E9[16]、E10[17]和J[24]已經被定位或克隆。其中，E1～E4基因是研究最為深入、應用最為廣泛的大豆生育期基因，研究表明E1～E4基因與大豆品種的生態類型密切相關，對大豆開花期變異貢獻率高達62%～66%[23]。分子水平的研究顯示E1～E4基因分別位于大豆基因組C2、O、L和I連鎖群上[20-23]。

大豆生育期基因E1是對大豆開花期及成熟期影響最大的E系列基因，主要功能是抑制開花和延長生育期。E1基因是豆科作物特有的轉錄因子，在四季豆(Phaseolusvulgaris)及百脈根(Lotusjaponicus)等豆科作物中存在同源性高的基因序列，在水稻與擬南芥中沒有相應同源序列[20, 25]。Zhang等[26]研究菜豆中E1同源基因Phvul.009G204600(PvE1L)和苜蓿中E1同源基因Medtr2g058520(MtE1L)，證明PvE1L基因能夠延遲大豆開花時間，而MtE1L基因對大豆的開花時間沒有影響，但MtE1L基因能夠促進苜蓿開花。推測豆科作物中E1基因家族在開花和植株生長調控作用中功能的保守性和變異性可能跟系譜和基因組復制有關。E1蛋白是一個具有轉錄抑制活性的轉錄因子，N端含一個雙元核定位信號，C端含有與植物轉錄因子B3遠緣相近的結構域[20]。E2基因與擬南芥GI(GIGANTEA)基因同源，對開花期的調控可能不受到光周期影響，而與生物鐘節律相關，不同環境條件下E2基因對開花期的作用相對穩定[19]。E3和E4基因分別編碼光敏色素A同源基因[22-23,27]，其但對光質量的反應既重疊又互不相同[22, 25, 28]。E3基因對光質的差異并不敏感，導致種植在不同光質長日照條件下植株的開花期相近[29]，E3與E4基因對E1基因的表達有調控作用[20]。

近年來各國學者廣泛開展E1～E4基因不同變異類型與不同大豆品種生態適應性關系研究。但是對變異類型的總結、鑒定和應用前景方面鮮有報道，中國亟待形成適應我國地域特點的基于E1～E4基因變異類型的分子輔助育種模式。本研究就E1～E4基因的不同變異類型、變異類型鑒定方法及各國學者針對世界各地不同大豆品種E1～E4基因開展的相關研究進行綜述，以期為大豆生育期遺傳調控機理的全面深入研究提供參考，同時為適應不同生態區域大豆遺傳育種工作提供依據，以期促進中國大豆生育期分子育種模式的形成。

1 大豆E1～E4基因的等位變異

1.1 E1基因類型變異

E1基因(Glyma06g23040.1)編碼區全長864 bp，沒有內含子。常見的E1基因變異類型包括e1-fs、e1-nl、e1-as和e1-b3a[20, 30]。e1-fs和e1-nl同為功能喪失型，均表現出極早的開花期和成熟期，e1-fs型實變體DNA序列49 bp處單堿基缺失導致移碼突變；e1-nl為基因整體缺失。e1-as基因型為非同義突變，DNA序列44 bp處出現單堿基突變，使編碼蛋白的定位發生變化，該基因型為早花型[20]。e1-as型開花及成熟期介于E1與功能喪失型(e1-fs及e1-nl)之間。e1-b3a型334～338 bp存在變異，在444 bp提前終止，蛋白質三級結構發生改變，定位于細胞核，該基因型也為早花型[29]。除此之外，e1-re基因型在e1基因起始位點上游148 bp處有1個3.1 kb 的LINE(long interspersed nuclear element)序列插入，該基因型的品種較基因型背景相近品種提前開花14 d[30]。e1-p基因型在E1基因5′側翼序列存在差異[30]。

1.2 E2基因變異類型

E2基因(Glyma10g36600)編碼區全長3 758 bp，包含14個外顯子，編碼1 170個氨基酸的蛋白。目前發現的E2基因變異類型有e2-ns、e2-in和e2-dl。e2-ns型最常見，編碼區內4個單堿基位點變異致使編碼序列提前終止。e2-ns基因型品種(Harosoy)較e2基因型品種(Clark)開花時間早[21]。e2-in和e2-dl型是E2基因的無義突變，分別為第8個內含子處36 bp插入和缺失，5′側翼序列均存在序列變異[30]。

1.3 E3基因變異類型

E3基因(Glyma19g41210)編碼區包含4個外顯子，編碼1 130個氨基酸的蛋白質。目前發現的E3基因的變異類型包括E3-Mi、e3-Ha、e3-T(e3-tr)、e3-Mo、e3-ns和e3-fs，其中e3-Mi、E3-Ha和e3-T型較常見。e3-Mi型編碼正常光敏色素A，e3-Mo型第四內含子處插入1個2 633 bp反轉錄轉座子且在第三外顯子處堿基序列改變導致編碼蛋白功能減弱，E3-Ha型包含1個與e3-Mo相似的反轉錄轉座子，但其編碼正常光敏色素A。e3-T型第三外顯子之后出現13.33 kb缺失，使組氨酸結構域出現部分缺失，導致編碼蛋白沒有功能[22]。e3-ns和e3-fs型是E3基因的無義突變型。e3-ns型第三外顯子單堿突變，e3-fs型第一外顯子單堿基插入導致移碼突變，序列提前終止[31]。

1.4 E4基因變異類型

E4基因(Glyma20g22160)編碼區包含4個外顯子，編碼1 123個氨基酸的GmPhyA2蛋白質序列。目前發現的E4基因變異類型包括e4-SORE1、e4-kam、e4-kes、e4-oto和e4-tsu。e4(e4-SORE-1)型第一外顯子存在6 238 bp的Ty1/copia-like反轉座子插入，插入序列中的終止密碼子使序列提前終止，產生功能缺失的蛋白序列。e4-kam和e4-kes型第二外顯子單堿基缺失和插入導致編碼蛋白的組氨酸激酶結構域缺失，而保留調控下游的PAS結構域。e4-oto和e4-tsu型分別為第一和第二外顯子單堿基缺失，導致組氨酸激酶結構域和PAS2結構域均缺失[28, 32]。

2 大豆E1～E4基因變異類型的分子標記鑒定

E1～E4，4個基因等位變異型的分子標記鑒定方法主要包括CAPS、dCAPS、InDel和FLP，根據其基因序列和長度設計引物，采用合適的限制性內切酶對其加以區分，如表1。

表1 E1～E4基因變異類型的鑒定Table 1 Identification of E1-E4 variation type

表1(續)

3 大豆E1～E4基因功能研究進展

3.1 E1～E4基因調控大豆開花時間

研究表明，大豆特異的調控開花的光周期通路PHYA(E3E4)-J-E1-FT，與擬南芥和水稻光周期反應的調控主通路CO-FT存在明顯差異。E3和E4基因編碼光反應通路必不可少的光敏色素，J基因編碼蛋白能夠結合在E1基因啟動子上，調控E1基因的表達，E1基因編碼豆科作物特有的和具有轉錄抑制功能的轉錄因子，負向調控大豆成花基因FT2a和FT5a的表達[20,24]。

E1～E4基因能夠調控大豆開花時間，有功能E1基因的轉錄豐度與開花時間顯著相關，基因表達量越高開花時間越晚，這一點在轉基因大豆和普通大豆品種中均被證實[2, 20]。E2基因是擬南芥生物鐘GI基因的同源基因，在長日照和短日照條件下均表現出節律性表達特性，純和隱性基因型e2/e2通過誘導GmFT2a的表達使大豆開花提前，而在不同光照條件下E2基因對開花期的作用相對穩定[21]。E3和E4基因編碼的光敏色素對不同光質的敏感性不同，不同緯度條件下，其對E1基因的表達量的影響隨緯度變化而有所改變。E3和E4基因所編碼的光敏色素蛋白對不同光質的敏感性不同，E3基因編碼的GmPhyA3對光質的差異并不敏感，導致種植在不同緯度植株的開花期差異不大。而隨著海拔的升高，R:FR逐漸變小，E4基因編碼的GmPhyA2對光照的敏感性明顯增強。隱性E3和E4基因同時存在才能使大豆品種表現出光照不敏感特征[10-11]。

3.2 E1～E4在大豆整個生長期的調控作用

E1基因正常表達能夠延遲開花，但不能延長生殖期，E2和E3基因正常表達能夠延長花期和開花后的時期，E4基因正常表達能夠推遲開花和成熟[12]。不論是開花前還是開花后的光周期反應中，光敏色素E3和E4基因都是主要調控者，基因型為E3或E4品種的繁殖期和開花后的莖生長對光照變化很敏感，原因在于GmphyA2和GmphyA3能夠調控生長習性Dt1基因表達，使莖尖分生組織的營養活動存在持續性[31]。隱性基因型e1、el-as、e2、e3和e4對于大豆品種在高寒地區的適應性具有重要意義，其可以不同程度地促進大豆開花和成熟，而且其隱性基因數量越多表現出的光周期不敏感性越強。研究表明絕大多數高寒地區大豆品種為e1/e2基因型[1,34]。對332個栽培大豆品種和85個野生大豆品種中e4-SORE-1基因型分布情況的研究結果表明，僅日本北部地區栽培大豆品種存在基因型為e4-SORE-1的品種，說明e4-SORE-1編碼功能缺失的GmphyA2，導致大豆植株表現光不敏感特性，從而適應高緯度生存環境[30, 35]。

4 大豆E1～E4等位變異在生育期研究中的應用

目前世界上大豆種植范圍已經超過50°N和40°S[36]。近年來各國學者廣泛研究不同地理區域大豆品種的E1～E4基因型，并對不同基因型組合品種生態適應性展開了更為深入的分析。目前，中國、日本、俄羅斯、哈薩克斯坦、美洲和歐洲等地區關于大豆品種E1～E4基因型鑒定與分析工作已經開展多年。

4.1 中國大豆品種E1～E4等位變異與生育期關系研究

2014年Zhai等[3]鑒定180個具有代表性的中國大豆品種E1～E4基因型，在全國主要大豆生態區的6個試點(33°57′～45°70′N，117°17′～126°64′E)對大豆開花期與成熟期進行表型觀察，結果表明E2基因的隱性基因型比率最高，高達84.45%。明確我國品種的基因型主要可分為8個類型，e1-nf、e1-asE4、E1-asE3E4、e1-asE2(E3)E4、E1、E1E4(E3)、E1E3E4和E1E2E3E4，其中E1E3E4為優勢基因型，占26.1%。e1-nf型(E1功能缺失型)開花最早，而來自南部地區的E1E2E3E4基因型品種不能適應高緯度地區日照時間較長的環境，開花很晚或者在高緯度地區霜凍之前沒有開花。研究發現不同品種中E1基因的表達量與大豆開花期呈極顯著相關。進一步證明E1～E4尤其是E1顯性基因對大豆光周期敏感性的抑制作用。e1-as具有一定抑制開花的功能，其對開花的抑制作用小于E1基因。

2017年Li等[37]研究299個中國大豆核心種質在中國4不同地區的成熟期，采用Sequenom MassARRAY iPLEX platform系統鑒定228個品種E1～E4基因型并分析其與開花期和成熟期的綜合效應。結果表明E1/e2-ns/E3/E4和E1/E2/E3/E4是主要基因型，4個基因的隱性基因型不同程度促進早花，而其顯性基因型在成熟期較長的品種中出現頻率較高。研究結果表明中國核心種質資源在基因型和表型上存在較大遺傳多樣性，能夠為中國大豆種植的生育區劃分和地理適應性分析提供重要信息，同時為培育適應特殊氣候環境的品種提供種質資源。

4.2 國外大豆品種E1～E4等位變異與生育期關系研究

國外大豆品種E1～E4基因型鑒定工作整體晚于中國，2014年Jiang等[35]檢測85個大豆品種的E1～E4基因型，其中除46個品種為中國品種外，還包括來自南美MG 000～MGV III和MG X的13個生育期組的38個大豆品種，1個俄羅斯大豆品種(50°N)，中國大豆品種中有4個為野生型大豆品種(23°N、39°N、46°N和50°N)。85個品種中共有10種基因型，其中E1/E2/E3/E4和E1/e2/E3/E4型是主要基因型。e1基因型大豆品種更適宜高緯度地區種植，e4等位變異對于大豆品種對高緯度地區的適應性具有重要意義，4個帶有隱性e4等位基因的品種均適應高緯度地區，并表現出光周期不敏感性。帶有等位基因e1、e1-as或e2的品種的出苗期～初花期天數變化范圍較出苗期～成熟期和初花期～成熟期短。

2017年Kurasch等[38]研究75個歐洲大豆品種E1～E4基因型與成熟期相關性狀。首次發現有兩個品種是雜合基因型品種，Ruzica品種的E3基因為雜合位點，基因型是e3-tr/e3-fs，Carla_TD品種的E4基因為雜合位點，基因型是E4/e4-SORE-1。沒有檢測出E1基因型的品種，在MG 000 和MG 00生育區檢測出4個e1-nl基因型品種，每個生育區中均有e1-as基因型品種。e1-nl基因型品種的開花和成熟時間最早，在所有22個種植地點都能成熟。與e1-as基因型品種相比，e1-nl基因型品種營養生長期在整個生長期的占比較長。該研究結果說明大豆光周期作用和E系列基因研究對歐洲栽培大豆品種生態適應性研究的重要意義。2017年Abugalieva等[39]鑒定了來自哈薩克斯坦農業科學院的120個品種(系)E1～E4基因型，這些品種是該地區育種工作的主要品種來源，研究材料來自西歐、東歐、北美、東亞和哈薩克斯坦5個地區12個國家。該研究共檢測到17個不同的基因型組合，5個主要組合是e1-as/e2/E3/E4、e1-as/e2/e3/E4、e1-as/e2/e3/e4、e1-nl/e2/E3/E4和e1-nl/e2/E3/e4。該研究分析了產量表型與基因型的關系，e1-as/e2/E3/E4基因型的品種(系)數量最多，但在3個地區都不是產量最高的基因型，具有顯性等位基因E3或E4基因的品種在這3個地區的產量均較高。5個主要組合的E2基因全部為隱性基因型。研究表明東南和東部地區形成一個整體環境，與需要種植成熟期較早的大豆品種的北部地區明顯區分開來，這些研究結果將為哈薩克斯坦大豆種植區的基因和表型模式關系的研究與應用提供參考。

2017年Langewisch等[1]鑒定238個大豆品種(系)E1/e1-as、E2/e2和E3-Ha/E3-Mi/e3-tr基因型，238個品種中127個為美國地方品種，48個為中國栽培大豆品種，17個為北美祖先品種，46個為北美栽培大豆品種，其中，40%品種采用分子標記方法鑒定，對60%品種進行重測序，利用Zhou等[40]的302個大豆品種的重測序SNP數據庫分析其基因型。結果表明，美國和加拿大現代大豆育種工作以有限親本材料為基礎，大部分親本材料來自中國，本土品種E1～E3基因等位變異類型存在局限性。美國MG 0～MG IV生育區錯誤的全部使用了基因型為e1-as的大豆品種，美國至少2 400萬hm2大豆產量受此限制。該研究形成基于大豆主要成熟期位點E1、E2和E3的美國大豆生育區分子育種模式，該模式能夠使育種者更高效的培育出適應不同生態區、具有特定農藝性狀的大豆品種。該方法也可以用于優化基因預測及篩選方案，從而整體提高美國和加拿大的大豆品種繁育效率。

不同大豆種植區的研究結果進一步說明盡管4個E基因不同變異的影響程度存在差異，但其不同基因型組合顯著地決定品種的生態適應性，4個E位點等位基因組合和相應分子標記技術能夠促進大豆分子繁育從而提高大豆產量。

5 展 望

E1變異基因型e1-b3a編碼蛋白具正常核定位信號，但B3結構域發生變異。e1-b3a在高緯度哈爾濱地區種植的開花期較E1基因型提前30 d，在淮安地區約提前10 d，而e1-b3a蛋白與E1蛋白的亞細胞定位結果一致，而與e1-as不同，證明B3結構域對E1基因生物學功能具有重要作用。Tsubokura等[28]發現少數品種為e1-re、e1-p、E2-in和E2-dl變異類型。對這些變異類型的深入研究將有助于對E1和E2基因功能的深入揭示。

E1～E4對開花的綜合貢獻估計高達62%～66%，還有目前尚不為人所知的基因控制[28]。已知基因(如E3、E4和J)和其他未知因素，至少可以通過調控E1基因表達來發揮作用[2, 24]。大豆中很多農藝性狀相關QTLs已經被定位但沒有克隆出來，相關基因的克隆將有助于對大豆生育期基因調控網絡特點的進一步認識[41]，最終實現對大豆生育期調控網絡的深入揭示。

重測序和Sequenom MassARRAY iPLEX platform系統等[37,40]更多新型、快速的鑒定方法將有助提高E1～E4基因型的鑒定效率，從而帶來高效率群體鑒定與分析的可能，包括E1～E4基因型鑒定在內的更多大豆農藝性狀相關基因的研究和鑒定將促進分子遺傳學研究結果應用到大豆育種工作中。