口腔扁平苔蘚黏膜病損區(qū)微生物群落分析

王雪薇，唐 楠，趙知白，范 媛

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其患病率為0.5%～2.2%[1]，多見于中年女性。OLP依據(jù)臨床表現(xiàn)包括斑紋型OLP和糜爛型OLP。盡管OLP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但OLP多與免疫系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)[2]。

人類口腔中的微生物群落約有700多種，主要由放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroid-etes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobact-eria)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)組成[3]。口腔微生物與宿主免疫密切相關(guān)，宿主的活化狀態(tài)和遺傳易感性可由特定微生物觸發(fā)或促進(jìn)[4]。宿主和微生物群的平衡關(guān)系一旦被破壞可通過不同機(jī)制引起舍格倫綜合征[5]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[6]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[7]等自身免疫性疾病。

目前OLP患者口腔微生物群落的研究多通過收集唾液和黏膜拭子。黏膜拭子作為一種非侵入性、低風(fēng)險(xiǎn)且省時(shí)廉價(jià)的取樣方法，多能被患者接受。He等[8]通過收集拭子發(fā)現(xiàn)OLP患者頰黏膜表面梭桿菌屬(Fusobacterium)、纖毛菌屬(Leptotrichia) 和勞特普羅菌屬(Lautropia)相對(duì)豐度顯著增加，而鏈球菌屬(Streptococcus)相對(duì)豐度在正常對(duì)照組顯著增加。為研究OLP患者口腔微生物群的變化，我們通過16S rDNA基因高通量測(cè)序，研究了斑紋型OLP、糜爛型OLP組和對(duì)照組口腔微生物群的組成概況，并評(píng)估了OLP組特定的微生物群落。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究招募2018年10—12月就診于江蘇省南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔黏膜病科的受試者，共篩選24例OLP患者(12例斑紋型OLP和12例糜爛型OLP)和8名正常對(duì)照組，所有OLP患者均符合1978年WHO對(duì)口腔扁平苔蘚的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]和2003年van der Meij等提出的臨床和病理學(xué)診斷[10]。所有受試者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①年齡25～69 歲。②取樣前1個(gè)月無抗生素及類固醇使用史、3個(gè)月未使用免疫調(diào)節(jié)劑。③無其他已知的口腔黏膜疾病、腫瘤和嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①藥物或銀汞材料引起的苔蘚樣反應(yīng)。②妊娠期、哺乳期及服用避孕藥者。③7 d內(nèi)使用漱口水者。④被診斷為牙周炎、牙髓病或存在可見齲病。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，且提供紙質(zhì)知情同意書，本研究程序符合赫爾辛基宣言。

1.2 樣本采集

所有OLP樣本均來源于患者頰或舌黏膜病損區(qū)的代表性部位，正常受試者樣本來源于正常的頰或舌黏膜。囑受試者漱口后，使用細(xì)胞刷(細(xì)胞收集器)緊貼在黏膜表面順時(shí)針旋轉(zhuǎn)20次收集黏膜表面微生物，立即儲(chǔ)存在凍存管中，置于 -20 ℃下冷凍直至進(jìn)一步分析。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)制造商的說明使用E.Z.N.A.?Soil DNA試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, 美國(guó)) 提取所有樣本的微生物DNA，PCR擴(kuò)增使用參數(shù)如下，95 ℃變性2 min，隨后在95 ℃下變性30 s進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，55 ℃退火30 s， 72 ℃延長(zhǎng)30 s，72 ℃溫育5 min。靶向16S rDNA編碼基因V3-V4高變區(qū)的通用PCR引物最終設(shè)計(jì):341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和806R:5′-GGACTACNNGGGTATCT-AAT-3′。

1.4 16S rDNA基因高通量測(cè)序

通過Illumina MiSeq平臺(tái)(上海凌恩生物科技有限公司)按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行配對(duì)測(cè)序(2×250)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用UPARSE(版本7.1)軟件在 97% 的相似水平下進(jìn)行 OTU 劃分，并使用UCHIME嵌合序列識(shí)別和移除。采用RDP classifier對(duì)silva (SSU132)16S rDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，置信閾值為70%[11]。使用Usearch 軟件(version 10)聚類和統(tǒng)計(jì)分析。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)計(jì)算各組間細(xì)菌類群的相對(duì)豐度。采用Mothur v.1.21.1[12]進(jìn)行多樣性分析，包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。使用UniFrac[13]進(jìn)行Beta多樣性分析，比較主成分分析的結(jié)果，使用community ecology軟件包和 R-forge (vegetarian 2.0)軟件生成PCA圖。線性判別分析效應(yīng)大小(LEfSe)分析采用Kruskal-Wallis、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)細(xì)菌分類群間的變化和差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS軟件(版本23.0,美國(guó))。P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 受試者和測(cè)序結(jié)果

所有受試者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)見表1，3組在年齡(P=0.143)和性別(P=0.152)方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。共獲得了共1 443 822個(gè)高質(zhì)量16S rDNA序列，優(yōu)化數(shù)據(jù)的序列平均長(zhǎng)度為423.66 bp。

表1 所有受試者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)Tab.1 The demographic and clinical data of all subjects

2.2 Alpha多樣性

斑紋型OLP、糜爛型OLP組和對(duì)照組的微生物豐富度(Chao1 指數(shù))和微生物多樣性(shannon指數(shù))，均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。OLP患者頰/舌黏膜微生物豐富度(Chao1 指數(shù))和多樣性(shannon 指數(shù))，也均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。

2.3 樣本間多樣性的主成分分析

我們通過基于加權(quán)的UniFrac系統(tǒng)發(fā)育距離矩陣計(jì)算beta多樣性來分析微生物群落結(jié)構(gòu)間差異，在Bray-Curtis距離主成分分析(PCA)圖(圖2A)中我們發(fā)現(xiàn)3組樣本間無明顯分離(ANOSIM，P=0.771)。在圖2B中，我們發(fā)現(xiàn)OLP組頰和舌黏膜樣本間也無明顯分離(ANOSIM，P=0.577)。

2.4 OLP組和對(duì)照組微生物群的組成差異

我們探討了OLP組口腔微生物群落特征，并比較了3組之間微生物群落的豐度差異。在門水平上的總體微生物組成(圖3A)表明，厚壁菌門是所有樣本的主要優(yōu)勢(shì)門，其次是變形菌門和擬桿菌門。在屬水平上(圖3B)，鏈球菌屬(Streptococcus)是主要的屬，其次有奈瑟菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)等。

A、B：斑紋型OLP、糜爛型OLP和對(duì)照組間Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)；C、D：OLP組頰與舌黏膜Chao 1指數(shù)和 Shannon指數(shù)

圖1不同分組Alpha多樣性

Fig.1Alpha diversity of different groups

A：斑紋型OLP(綠色菱形)、糜爛型OLP(紅色圓圈)和對(duì)照組(藍(lán)色正方形)；B：OLP組頰黏膜(藍(lán)色圓圈)和舌黏膜(紅色正方形)；每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，并按樣本類型著色。相似的樣本越多，其在圖中就越接近

圖2基于加權(quán)Unifrac距離矩陣的菌群主成份分析圖

Fig.2Principal component analysis of flora basedon weighted unifrac distance matrix

與對(duì)照組相比，在屬水平，艾肯菌屬和小鏈菌屬的相對(duì)豐度在OLP組顯著較高。在種水平，膿腫分枝桿菌、馬氏普雷沃氏菌、頰纖毛菌C-1013-b和苛養(yǎng)顆粒鏈球菌的相對(duì)豐度在OLP組顯著較對(duì)照組高，其中，馬氏普雷沃氏菌的相對(duì)豐度在糜爛型OLP組顯著較斑紋型OLP組高(P=0.001)。土壤桿菌屬的相對(duì)豐度在斑紋型OLP組(P=0.008)和糜爛型OLP組(P=0.032)均顯著較對(duì)照組低，但斑紋型OLP和糜爛型OLP間無顯著差異(P>0.05)。唾液鏈球菌唾液亞種在斑紋型OLP(P=0.003)和糜爛型OLP(P=0.000)的相對(duì)豐度均顯著低于對(duì)照組，且在糜爛型OLP組最低。

繪制Venn 圖(圖3C)表示3組的共享和特有的OTU。結(jié)果表明，斑紋型OLP組、糜爛型OLP組和對(duì)照組的核心OTU分別由3 554個(gè)、3 398個(gè)和5 445個(gè)OTU組成，其中2 482個(gè)OTU為3組共有。

A、B：依次為對(duì)照組、斑紋型OLP組和糜爛型OLP組在門和屬水平分類的柱狀圖；C：不同分組間微生物多樣性的Venn圖，不同組成部分中的數(shù)字表示3組間特有或共有的OTU序列數(shù)；綠色圓圈代表對(duì)照組，藍(lán)色圓圈代表斑紋型OLP組，紅色圓圈代表糜爛型OLP組

圖3微生物群組成分析

Fig.3Analysis of microbial population composition

2.5 分類豐度差異

使用LEfSe圖在不同物種水平進(jìn)行分析，通過LDA得分來區(qū)分3組的口腔微生物群落(圖4)。與對(duì)照組相比，氣球菌科(Aerococcaceae)、貧養(yǎng)菌屬(Abiotrophia)、小鏈菌屬和柯林斯菌屬(Collinsella)的相對(duì)豐度在斑紋型OLP組顯著增加。而黃桿菌目(Flavobacteriales) 、埃格特菌科(Eggerthellaceae)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae)、消化厭氧桿菌屬(Peptoanaerobacter)和艾肯菌屬的相對(duì)豐度在糜爛型OLP組顯著較對(duì)照組高。小鏈菌屬和柯林斯菌屬相對(duì)豐度在OLP組顯著較對(duì)照組高。

2.6 OLP組和對(duì)照組平均相對(duì)豐度>0.2% 的屬相關(guān)性heatmap圖分析

從圖5我們可以看出，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和葉桿菌屬(Phyllobacterium)最為正相關(guān)(ρ=0.92)，而慢生根瘤菌屬和奈瑟菌屬最為負(fù)相關(guān)(ρ=-0.56)。

2.7 未獲培養(yǎng)或難獲培養(yǎng)微生物

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌檢出率為99.89%，有0.1%的微生物屬于未獲培養(yǎng)的微生物或未分類的群體。在能夠分離培養(yǎng)出的細(xì)菌中，有0.007%的細(xì)菌在門水平未獲培養(yǎng)或難獲培養(yǎng)。

3 討 論

微生物對(duì)疾病的作用不是因?yàn)樗鼈兊拇嬖冢怯捎谖⑸锶郝浣M成之間的失衡[14]。了解OLP患者與正常人之間微生物群的關(guān)系，可在預(yù)防和治療OLP方面起重要作用。我們采用拭子收集的OLP病損區(qū)微生物群落，發(fā)現(xiàn)OLP組與對(duì)照組之間雖然微生物多樣性、豐富度和群落結(jié)構(gòu)方面無顯著差異，但兩組間微生物群落組成仍有不同。

A、B、C：依次為對(duì)照組和斑紋型OLP組、對(duì)照組和糜爛型OLP組、對(duì)照組和OLP組Lefse分析圖(左)和LDA得分圖(右)；僅列出LDA得分≥2

圖4各分組分類豐度差異

Fig.4Difference in abundance of classificationof each group

圓圈越大，相關(guān)系數(shù)越高；藍(lán)色代表正相關(guān)，紅色代表負(fù)相關(guān)；相關(guān)值從-1.00(紅色)到1.00(藍(lán)色)

圖5對(duì)照組和OLP組平均相對(duì)豐度>0.2%的屬Pearson相關(guān)矩陣可視化圖

Fig.5Pearson correlation matrix visualization of salivahealthy controls and OLP with genera averagerelative abundance>0.2%

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OLP組馬氏普雷沃氏菌的相對(duì)豐度顯著較對(duì)照組高，且糜爛型OLP較斑紋型OLP高。該菌可從健康受試者的齦下菌斑中分離，也可從患有牙髓和牙周感染的患者中分離[15]。Said等[16]報(bào)道厭氧菌普氏菌屬(Prevotella)與黏膜炎癥反應(yīng)有關(guān)。此外，Larsen[17]發(fā)現(xiàn)普氏菌屬豐度的增加不僅與Th17介導(dǎo)的黏膜炎癥相關(guān)，還能促進(jìn)黏膜Th17免疫反應(yīng)和中性粒細(xì)胞的募集，從而促進(jìn)慢性炎癥。本實(shí)驗(yàn)排除了患有牙髓病及牙周病的患者，因此我們認(rèn)為馬氏普雷沃氏菌豐度的增加可能與宿主免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

與對(duì)照組相比，在OLP組相對(duì)豐度顯著增加的微生物還有艾肯菌屬、膿腫分枝桿菌和苛養(yǎng)顆粒鏈球菌。侵蝕艾肯菌(Eikenellacorrodens)可引起炎癥和感染性疾病，包括種植體周圍炎[18]和髖關(guān)節(jié)感染[19]。膿腫分枝桿菌在口腔多與菌斑相關(guān)[20]，有研究表明，OLP患者牙周狀況較差[21]，因此，膿腫分枝桿菌可能參與了OLP的發(fā)展。苛養(yǎng)顆粒鏈球菌多與感染相關(guān)，如感染性心內(nèi)膜炎[22]等疾病。

此外，OLP組和對(duì)照組間微生物組成的變化還可通過某些微生物相對(duì)豐度的減少來解釋。我們發(fā)現(xiàn)斑紋和糜爛型OLP患者土壤桿菌屬相對(duì)豐度均較對(duì)照組低。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)屬于變形菌門的土壤桿菌屬相對(duì)豐度在特應(yīng)性皮炎患者較健康皮膚低。Larsen等[23]研究表明2型糖尿病患者腸道變形菌門的比例明顯較正常對(duì)照組低。唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)具有抗炎特性，Zheng等[24]報(bào)道患有濕疹嬰兒的唾液鏈球菌相對(duì)豐度較對(duì)照低。本研究表明唾液鏈球菌唾液亞種的相對(duì)豐度在斑紋和糜爛型OLP組均低于對(duì)照組。

自然界中絕大多數(shù)微生物是未獲或難獲培養(yǎng)的[25]。雖然16S rDNA測(cè)序能夠培養(yǎng)出絕大多數(shù)細(xì)菌，但仍有少量未獲或難獲培養(yǎng)的微生物。這些微生物中可能仍存在與OLP相關(guān)的致病菌。目前，我們僅初步探討了OLP局部病損區(qū)細(xì)菌菌群。對(duì)于這些未獲或難獲培養(yǎng)的可疑微生物群可采用宏基因組學(xué)[26]、元轉(zhuǎn)錄組學(xué)[26]、反向基因組學(xué)[27]或設(shè)計(jì)針對(duì)性的PCR引物以進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，口腔微生物群在人類健康中發(fā)揮著重要的作用，口腔菌群失調(diào)不僅會(huì)導(dǎo)致口腔疾病，還會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性疾病，且不同疾病狀態(tài)及不同區(qū)域微生物定植情況有所差異[28]。OLP的發(fā)生和發(fā)展可能與微生物失調(diào)參與宿主免疫、炎癥和感染有關(guān)。雖然我們的樣本規(guī)模不大，但值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)OLP患者頰和舌黏膜病損區(qū)微生物多樣性、豐富度和群落結(jié)構(gòu)均無顯著差異。為充分了解OLP患者各病損區(qū)微生物群的微妙變化，仍需行大規(guī)模研究，以探索OLP特定病損區(qū)微生物群落的改變，從而有助于為OLP制定更有效的預(yù)防和治療策略。