硅酸鈣生物材料誘導牙源性干細胞成牙/成骨分化機制的研究進展

周 楊，李 謹，朱慶萍，吳大明

自上世紀90年代以來，以硅酸三鈣和硅酸二鈣為主要成分的硅酸鈣材料(calcium silicate cements, CSCs)備受關注。CSCs能釋放生物活性離子Ca2+和Si4+，提高局部pH，促進磷灰石形成[1-2]；通過增加促血管生成因子(如VEGF、FGF)和內皮細胞中的受體表達來模擬缺氧條件刺激血管生成[3]。CSCs通過誘導信號分子、通路、受體和轉錄控制系統組成的復雜網絡(表1)促進硬組織再生，誘導骨髓基質細胞(bone marrow derived stroma cell，BMSC)、牙髓細胞(dental pulp cell, DPSC)、牙周韌帶細胞(periodontal ligament stem cell, PDLSC)、根尖乳頭干細胞(stem cell of the apical papilla，SCAP)的成牙/成骨分化[4-39]。以三氧化物聚合物(mineral trioxide aggregate, MTA)為代表的CSCs已被廣泛應用于蓋髓術、牙髓切斷術、穿孔修補和根尖屏障等牙髓治療中[2-5]。本文就目前臨床常見的CSCs的成牙/成骨相關機制進行綜述。

表1 CSCs通過信號分子、通路、受體和轉錄控制系統誘導干細胞成牙/成骨分化Tab.1 CSCs induce odonto/osteogenic differentiation of stem cells via signal molecules，pathways，receptors and transcriptional control systems

1 MTA

MTA主要由硅酸三鈣/二鈣，鋁酸三鈣，鐵鋁酸四鈣，石膏和二氧化鉍組成，在溶液中呈堿性(pH為10.2～12.5), 具有良好的磷灰石形成能力[2]。與傳統蓋髓劑氫氧化鈣[Ca(OH)2，CH]相比，MTA誘導牙本質橋形成的頻率更高，且形成的牙本質更厚、孔隙更少，展現出良好的生物相容性、抗菌性、抗炎性和成骨性[7]。

MTA可刺激多種干細胞的成牙/成骨分化包括脂肪干細胞、BMSC、DPSC、PDLSC和SCAP，誘導硬組織再生。MTA誘導牙源性干細胞成牙/成骨分化的機制與釋放Ca2+有關[4]。MTA釋放Ca2+和OH-與組織間液中的磷酸基團反應形成羥磷灰石(hydroxy apatite, HA)，OH-參與礦化過程的ALP和BMP-2的釋放，Ca2+濃度的局部增加上調了細胞外鈣敏感受體(CaSR)活性，激活多種信號傳導途徑以促進不同譜系細胞分化[4]。Wang等發現MTA中的Ca2+觸發ERK和p38途徑修飾細胞表型，上調ALP、Runx2、OSX和OCN的表達，并證實MTA通過NF-κB、MAPK通路協同介導PDLSC的成牙/成骨分化[8]；Yan等證實MTA通過上調炎性細胞因子(IL-1α、IL-1β和TNF-α)、刺激IκB激酶(IKK)磷酸化和NF-κB亞基的易位，增強SCAP的成牙/成骨分化[9]。

MTA存在操作敏感性高、凝固時間長、導致牙齒變色等缺點[2]。另外，酸性環境能改變MTA表面顯微結構，增加溶解性，抑制MTA的固化反應、降低封閉能力、削弱微硬度和對牙本質的結合能力[12]。應用納米技術改性的MTA可以更快地與水反應，顯著增加Ca2+釋放，提升pH值，與活組織接觸時炎癥反應也較輕[10]。

2 iRoot

iRoot是一種新型CSCs納米材料，主要由硅酸三鈣/二鈣、磷酸鈣、氧化鉭和氧化鋯組成。與MTA不同的是，iRoot不含鋁，由氧化鉭和氧化鋯替代二氧化鉍作為阻射劑，規避二氧化鉍導致的牙齒變色[2]。該類產品包括iRoot SP、iRoot BP、iRoot BP Plus、iRoot FS、iRoot FM等，這些新型材料可注射使用，不溶解收縮，封閉性好，具有良好的生物相容性、抗菌性和誘導成骨性能[11-14]。

iRoot SP通過活化整合素受體及下游信號分子，包括粘著斑激酶(FAK)、MAPK、NF-κB、Akt，誘導低水平炎癥介質表達并增強PDLSC成骨分化[11]。

iRoot BP Plus展示與MTA相似或更好的HA形成能力、生物相容性和誘導成骨能力[12]。iRoot BP Plus直接蓋髓后，在牙髓界面形成鈣化橋，牙髓組織無炎癥反應，且比MTA能更好地形成HA、促進細胞增殖和誘導成骨；在炎癥導致的酸性環境中釋放更多的Ca2+和Si4+，提升了細胞活性，有助于成骨細胞分化；釋放的Si4+和OH-可抑制破骨細胞生成和骨吸收，改善根尖組織愈合[12]。此外，iRoot BP Plus可激活FGFR介導的MAPK和PI3K/Akt通路并促進DPSC的細胞遷移[13]。

iRoot FS和MTA有相似的根尖封閉能力和機械性能，能引起ALP、COL、OCN上調，促進人PDLSC的附著、增殖和生物礦化[15]。iRoot FS提升DPSC的增殖、遷移和成骨分化。DPSC間充質干細胞表面標記物CD29、CD44表達水平高于9%，CD105表達水平高于34%，內皮細胞標記物CD31或造血干細胞標記物CD34、CD35表達水平低于0.8%，提示DPSC展示持續和高典型的間充質干細胞表面標記表達，細胞增殖隨著時間而增加[16]。iRoot FM也能顯著增強SCAP的DMP-1和ALP表達，同時具有與CH相似的抗菌效果[17]。

不同的iRoot產品成分類似，但劑型不同，應用范圍也有差異。由于iRoot是納米改性，可即刻使用，有望成為MTA的替代品。但是iRoot固化時間與溫度有關，溫度升高后其流動性和多孔性降低，影響熱壓膠垂直加壓充填的臨床操作和充填質量。此外該材料在國內應用不久，目前仍缺乏大量臨床實驗以評價其在人體內促進牙本質橋形成能力、邊緣封閉性等特性。

3 生物活性玻璃/介孔生物活性玻璃

以Bioglass 45S5為代表的生物玻璃(bioactive glasses, BG)，因其優異的生物相容性、促骨和血管生成能力而備受關注[19]。BG可刺激成骨細胞增殖并增加成骨細胞相關基因活性(如ALP、OPN和COL)，BG / HA / PE復合物促進了小鼠前成骨細胞MC3TC-E1增殖，其潛在機制是BG上調Runx2的表達并激活TAZ / YAP信號通路以加速骨化相關蛋白的產生[39]。

近年來，Yan等[19]通過溶膠-凝膠法制備內部含有有序介孔通道(5～20 nm)的介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glasses, MBG)。相對于傳統的BG，MBG的突出優勢是其強大的藥物負載與釋放能力。MBG能與液體產生更快、更強的離子交換(主要是Ca2+和Si4+)，釋放更強的成骨活性[18-19]。MBG促使更多的破骨細胞與胰島素生長因子-1(IGF-1)結合，通過信號逐級反應降解骨細胞外基質(ECM)，同時分泌酸和蛋白水解酶，有助于骨骼重建[32]。Jia等[20]和Yin等[21]先后制備了負載鍶(Sr)、硼(B)的MBG支架(Sr-MBG，B-MBG)，并證實Sr-MBG通過激活MAPK通路調節Setd2表達，B-MBG通過激活Wnt/β-連環蛋白信號通路調節Setd7表達，誘導成骨細胞分化和新骨形成。

與MTA相比，MBG獨特的介孔結構可用作多功能、可調節的藥物及生物活性分子遞送平臺，在誘導牙/骨新生的同時抵抗根管中細菌生物膜感染[1]。但MBG的粒徑通常為微米級，不易注射，且固體粉末不利于藥物輸送，目前尚難以應用于臨床的牙髓治療。

4 介孔鈣/硅納米材料

介孔硅納米粒子(mesoporous silica nanoparticle, MSN)因其良好的生物相容性和生物降解性，常被用作支架材料[22]。MSN通過水解Si—O鍵，釋放正硅酸，生成水溶性Si，刺激人BMSC的COL合成和成骨分化[29]。MSN在消耗Ca/P荷載后持續釋放正硅酸，因此在不同骨生成階段均有骨刺激作用。

介孔鈣硅納米粒子(mesoporous calcium-silicate nanoparticles，MCSNs)元素組成近似MTA和iRoot，具有有序的介孔結構(平均5 nm)，高比表面積(平均300 m2/g)，富含Si—OH基團，能負載和緩釋藥物及生長因子，是優良的生物載體和骨再生平臺[22-23]。Wu等[23]研究證實MCSNs具有良好的抗菌性、促HA形成、刺激PDLSC成骨基因表達等優點。MCSNs誘導干細胞成牙/成骨本質可能與Ca2+和Si4+的持續釋放有關。Ca2+引起細胞內鈣濃度增加，激活鈣調蛋白(CaM)，進而使鈣調依賴蛋白激酶(CaMKII)、鈣調神經磷酸酶(Cn)活化，影響AP-1等轉錄因子家族基因的表達[4]；Si4+促使細胞進入S和G2期，增強細胞增殖分化，在骨和軟骨形成、血管新生、膠原蛋白合成、結締組織交聯等組織再生中起關鍵作用；此外還能激活ERK途徑誘導DPSC牙源性分化[24]。近來，Huang等[25]制備負載BMP-2的MCSNs復合支架，證實該支架作為BMP-2輸送系統表現良好，不僅增強了DPSC成牙/成骨活性，而且提高了生長因子的釋放速率。

MCSNs與MBG同屬介孔材料，可攜帶藥物或生物活性分子，在骨缺損修復、細胞內分子標記、藥物傳輸和基因打靶等生物工程中有著廣闊的應用前景。MCSNs與殼聚糖、聚己內酯等有機材料制備復合支架[33]，協同生長因子或生物活性元素，有望成為牙髓再生治療中保護血凝塊、誘導硬組織新生的內部支架；此外MCSNs負載抗菌藥物，粘附于根管壁并滲入牙本質小管中[23]，可發展成為新型根管內消毒劑。然而，如何開發成熟的產品體系，最大效率發揮MCSNs生物學活性并兼顧操作便捷性，是未來研究的重點。

5 BioAggregate(BA)

BA是一種新型納米CSCs，由水合硅酸鈣、CH、HA及氧化鉭組成，無牙變色風險，根尖封閉性及生物相容性與MTA相似[26-27]。BA通過MAPK途徑誘導DPSC分化和礦化結節形成，上調DSPP和DMP-1的表達[27]。BA還能降低破骨細胞組織蛋白K(Cathepsin-K)及其上游活化T-細胞核因子1(NFATc1)和c-Fos的表達水平[26,38]，在LPS誘導的小鼠顱骨缺損模型中，BA表現出對體內破骨細胞分化和炎性骨吸收具有與MTA相當的抑制作用[26]。

BA成分與MTA相似，但不含鋁，降低了對人體的潛在毒性，且BA中HA組分的存在增加了材料的強度，展現出優異的生物相容性、誘導硬組織形成能力。然而BA若要取代MTA尚存在較多問題，如在相同的環境下，BA的粘結性能弱于MTA，而理想的髓腔穿孔修補材料應與牙本質緊密連接以隔絕外界物質；如何增強BA抗菌作用以抵抗牙髓治療后微生物再感染等也有待進一步研究。

6 BiodentineTM(BD)

BD是2009年問世的生物性牙本質替代材料，是一種高純度硅酸三鈣粉末，含少量的硅酸二鈣、碳酸鈣、氧化鋯等,在抗壓強度、粘合強度、密封性能及Ca2+釋放能力等方面具有與MTA相當甚至更好的性能[6,30-31]。

BD用于直接蓋髓時，誘導DPSC分泌TGF-β1刺激早期修復性牙本質生成[35]，該過程涉及MAPK和CaMKII通路，其中MAPK主要是ERK和JNK，選擇性阻斷p38途徑則對成骨基因的表達沒有明顯影響[36]。BD通過調控血紅素氧合酶l(HO-1)、活性氧(ROS)、Nrf2的表達誘導DPSC成牙本質細胞分化[34]。利用BD培養乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)的體外實驗表明該材料有利于SHED的附著和增殖，并通過與細胞微環境離子交互觸發牙源性分化[31]。此外，BD還可刺激SCAP血管生成基因(如VEGFA、VEGFD/ FIGF)的表達，顯著降低血管生成素1(Ang 1)和FGF-2的mRNA水平，改善血管再生、軟組織愈合[37]。Kim等建立大鼠牙髓損傷模型，采用ProRoot MTA、BA及BD蓋髓，組織免疫分析和Micro-CT的結果表明BA和BD均可促進DPSC成牙/成骨分化，加快體內牙本質橋的形成[28]。

與MTA相比，BD凝固時間短，易于操作，應用于穿孔修復時具有良好的外推式粘合強度和修補效果；同時BD具有與天然牙本質類似的生物學性能及較高的機械強度，對于提升牙髓治療后牙齒抗折性效果更為顯著。BD是粉末膠囊劑型，顆粒均勻，孔隙度小，質地致密，與根管壁牙本質界面密封性能好，可大大減少細菌微滲漏[40]。上述特性使得BD在牙體牙髓疾病的臨床治療前景廣闊。但是BD調制后一次使用不完易造成浪費，若自行調拌則會因粉液比不當而影響其固化時間，操作性仍需改進。

7 總 結

在牙髓病學領域，發展生物活性材料的重點是提高其抗菌效果、促進病變牙本質基質的機械完整性和組織再生[2]。生物安全性、生物相容性及生物功能性是生物活性材料研發的重點。上述CSCs在基礎研究中被證實具有優異的成牙/成骨特性。 MTA已廣泛應用于臨床上，iRoot系列產品正逐漸普及，但其價格較高，讓很多醫生仍然選擇了傳統的MTA。其他幾種CSCs目前在臨床上尚未廣泛推廣，其臨床療效仍需大量的病例和長時間的追蹤來客觀評價。