柚皮素標準物質的研制及不確定度評定

劉金濤，李 玲，董家吏，焦必寧，蘇學素*

(1.西南大學 化學化工學院，重慶 400715；2.中國農業科學院/西南大學柑橘研究所，農業農村部柑橘產業質量安全風險評估實驗室，重慶 400712)

圖1 柚皮素的分子結構

標準物質具有一種或多種足夠均勻和準確的特性值、高精確度和溯源性，可用來校準測量裝置，評價測量方法或給材料賦值，是測試分析技術的保障、量值傳遞和量值溯源的基礎[1]。

柚皮素(Naringenin)屬于二氫黃酮類化合物，是柚皮苷的苷元，主要存在于柑橘類水果、蔬菜、堅果及其他植物中[2]，其分子式為C15H12O5，分子結構見圖1。病理學研究表明，柚皮素具有抗菌消炎、抗癌、抗腫瘤、改善糖尿病、預防老年癡呆癥等多種生理功能[3-5]，可被開發應用于食品和藥品行業。目前，我國尚無市售柚皮素純度標準物質，研制柚皮素標準物質能夠保證柚皮素檢測結果的準確性、可比性和溯源性。質量平衡法可直接溯源到國際單位制(SI)中的質量(kg)，是一種潛在的基準方法，被世界衛生組織和歐洲藥典推薦為藥品標準物質定值方法[6-7]。差示掃描量熱法(DSC)具備試樣用量少、操作簡單、無需分離雜質、能測定物質的絕對純度等優點，適合于高純度化工醫藥產品的測定，是美國藥典推薦的藥品純度檢驗及生產質量控制方面的首選方法[8]。本研究同時采用以上兩種方法對柚皮素標準物質進行定值分析，其中質量平衡法包括液相色譜法測定主成分的含量，以及水分、無機雜質和殘留溶劑的分析。根據標準物質研制的相關要求和技術規范，對柚皮素標準物質進行均勻性檢驗、穩定性考察及不確定度評價[9]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

600 MHz核磁共振譜儀(瑞士Bruck公司)；紫外可見近紅外光譜儀(日立有限公司)；HP1200高效液相色譜儀，VWD檢測器(美國Agilent公司)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；XC841遠紅外鼓風干燥箱(吳江市新成烘箱制造廠)；ZF-1三用紫外分析儀(上海力辰科技有限公司)；DL32型卡爾費休水分測定儀，XS205十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒公司)；DSC60-Plus(日本島津公司)；Agilent5110ICP-OES，Agilent 6890N氣相色譜儀,Agilent G1888頂空進樣器(美國Agilent公司)；Y101超純水儀(美國Millipore公司)。

柚皮素樣品(上海源葉生物有限公司，純度98.5%)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、氯仿、二氯甲烷、無水乙醇(色譜純，美國Merck公司)；C18硅膠(美國Sigma公司)；液體水分含量標準物質(GBWE130654)。

1.2 標準物質的制備

將150 g反相C18硅膠在甲醇中浸泡12 h，搖勻裝入內徑40 mm的層析柱中，以洗脫劑水-甲醇(65∶35，體積比)平衡層析柱。稱取300 mg柚皮素樣品，用3.9 mL甲醇溶解后加入2.1 mL超純水，搖勻，用滴管緩慢滴入層析柱中，加入洗脫劑水-甲醇(65∶35)洗脫，并用20 mL玻璃試管收集洗脫液，隨后用毛細管吸取少量洗脫液在硅膠板上點樣，將可在紫外燈下顯色的洗脫液合并，旋蒸除去溶劑，即得到標準物質樣品。經液相檢測，樣品純度從98.89%提高到99.85%。重復上述操作，將得到的柚皮素標準物質樣品混合均勻，于105 ℃烘箱中干燥6 h，分裝到棕色樣品瓶中，每個單元包裝量為20 mg，共制備120瓶。

1.3 實驗條件

1.3.1 液相色譜分析條件通過優化色譜柱種類(XDB-C18、SB-C18和XBridge-C18)、流動相比例(V水相∶V有機相=60∶40、65∶35、70∶30)以及樣品質量濃度(100、300、500、700、1 000 mg/L)，得到液相色譜定值條件為：Agilent1200液相色譜儀；Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：0.2%乙酸水溶液-乙腈(70∶30)；流速：1 mL/min；進樣量：5 μL；樣品質量濃度：700 mg/L；檢測波長：290 nm。

1.3.2 水分測定條件將樣品于105 ℃烘箱中干燥6 h后進行水分測定。環境條件為溫度：25 ℃，濕度：23%。開啟卡爾費休水分儀，待儀器穩定后開始測定。用微量注射器吸取30 μL液體水分含量標準物質對儀器進行校準。每次準確稱取10 mg樣品，迅速加入滴定池內，輸入稱樣質量，讀取水分值。

1.3.3 殘留溶劑測定條件色譜柱：DB-624(0.32 mm×1.8 μm,30 m)，載氣：氫氣，流速：40 mL/min，空氣流速：400 mL/min，檢測器溫度：260 ℃；程序升溫條件：初始溫度保持5 min，以7 ℃/min的速率升溫至60 ℃，再以15 ℃/min的速率升溫至190 ℃。

頂空進樣器條件：進樣量：1 mL；恒溫爐溫度：90 ℃；樣品流路溫度：105 ℃；傳輸線溫度：120 ℃。

1.3.4 無機雜質測定條件ICP-OES儀器工作參數：射頻功率：1 300 W；等離子體流速：4 L/min；輔助氣流速(Ar)：5 L/min；觀察高度：7.8 mm；蠕動泵轉速：30 r/min；檢測時間20 s。

1.3.5 DSC測定條件準確稱取4～6 mg樣品于鋁坩堝中，用卷邊器密封，置于DSC儀中。參比：空的40 μL標準鋁坩堝；N2流速：50 mL/min；程序升溫：20～230 ℃，10 ℃/min；230～260 ℃，1 ℃/min；純度分析軟件：TA acquisition。

1.4 均勻性檢驗與穩定性考察

根據標準物質研制的技術規范，從分裝好的120瓶樣品中，隨機抽取15瓶進行編號，每個樣品平行測定3次。用甲醇溶解，配成質量濃度為700 mg/L的溶液，采用高效液相色譜法進行純度檢測，測得數據采用方差分析法(F檢驗法)進行統計檢驗。

采用線性擬合法對柚皮素標準物質進行長期和短期穩定性考察。長期穩定性考察：將樣品保存在4 ℃條件下，用液相色譜法在第0、1、2、4、6月進行檢測，每次抽取2個樣品單元，每個單元重復測定3次。短期穩定性考察：取3組樣品(每組5瓶)分別在20、40、60 ℃條件下保存，于第1、3、5、7、9 d取樣進行檢測，采用趨勢分析(t檢驗法)對數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 原料定性分析

在紅外光譜儀上測定柚皮素的紅外光譜，3 279 cm-1處有強而寬的吸收峰，為羥基的伸縮振動峰，由氫鍵締合后的羥基引起；1 633 cm-1處的強吸收為羰基的伸縮振動峰；1 518、1 497、1 463 cm-1處為苯環骨架的伸縮振動峰。樣品的紅外譜圖(圖2A)與標準紅外譜圖(圖2B)吸收峰一致。

圖2 柚皮素樣品紅外光譜(A)與柚皮素標準紅外光譜(B)

測定柚皮素樣品的核磁共振氫譜，其化學位移及對應的質子數為：12.15(1H,s,Ar-OH),10.76(1H,s,Ar-OH),9.57(1H,s,Ar-OH),7.32(2H,dd,J=8.5,4.9 Hz,H-2*,H-6*),6.80(2H,d,J=1.2 Hz,H-6,H-8),5.89(2H,m,H-3*,H-5*),5.43(1H,m,H-2),3.23(1H,m,H-3),2.88-2.61(1H,m,H-3)。樣品的核磁氫譜與標準核磁氫譜相同(圖3)。因此可以確認樣品為柚皮素。

圖3 柚皮素樣品核磁氫譜(A)與柚皮素標準核磁氫譜(B)

2.2 純度定值

為了提高定值準確度，同時采用質量平衡法和差示掃描量熱法兩種不同原理的方法對柚皮素標準物質進行定值分析。

2.2.1 質量平衡法質量平衡法又叫雜質扣除法，指通過測定所有雜質的含量從而得到樣品的純度[10]。由于液相色譜面積歸一化法測定純度值的局限性，樣品中的水分、無機雜質和殘留溶劑均無法檢出[11]。因此分別采用卡爾費休庫倫法、等離子體原子吸收光譜法和頂空氣相色譜法測定樣品中相關雜質的含量，并對結果進行校正。

純度計算公式為：PMB=(1-Xmoi-Xele-Xvola)·P0

(1)

圖4 柚皮素標準物質液相定值色譜圖

圖5 柚皮素標準物質的DSC圖譜

式中：PMB為質量平衡法定值結果；P0為主成分含量；Xmoi為水分含量；Xele為無機雜質含量；Xvola為殘留溶劑含量。

(1)主成分的測定：采用液相色譜法測定柚皮素主成分的含量，重復測定7次，主成分測定結果的平均值為99.85%，液相定值色譜圖如圖4所示。

(2)水分、殘留溶劑和無機雜質的測定：樣品在105 ℃干燥6 h后采用卡爾費休庫倫法測定水分值，殘留溶劑含量采用頂空氣相色譜法測定，無機雜質含量采用ICP-OES法測定，測定結果如表1所示。結果顯示，柚皮素標準物質水分含量為0.655 1%,無機雜質含量為0.004 27%,殘留溶劑含量為0.042 57%。質量平衡法得到的柚皮素標準物質的純度值為99.14%。

2.2.2 DSC法DSC法測定樣品的純度以范德霍夫熔點下降理論為依據，由于柚皮素含有雜質，其熔點有所降低，熔點的降低值與雜質的摩爾分數之間符合范德霍夫方程[12-14]：

(2)

式中，T0為純樣品的熔化溫度；TS為實際樣品的熔化溫度；R為氣體常數；ΔHf為純樣品的摩爾熔化焓；F為熔化了的樣品分數；x為雜質摩爾分數。

表1 柚皮素標準物質定值結果

柚皮素的DSC測定曲線如圖5所示，DSC法得到的柚皮素標準物質純度值為99.16%(表1)。將質量平衡法和DSC法測得的兩組數據進行等精度檢驗，t(0.80)

2.3 均勻性檢驗結果

高效液相色譜法均勻性檢驗結果見表2，經計算F=2.01，查臨界值表F0.05(14,30)=2.04。F

表2 柚皮素標準物質均勻性檢驗結果

2.4 穩定性檢驗結果

2.4.1 長期穩定性檢驗結果通過高效液相色譜法對柚皮素標準物質進行長期穩定性檢驗，結果見表3。采用線性擬合法進行分析。以x代表時間，y代表純度值，擬合成一條直線，設時間對純度值的方程為y=b0+b1x，采用t檢驗法來檢驗斜率b1的顯著性,從而評估長期穩定性。當|b1|>t0.95,n-2·S(b1)時,斜率被認為在統計學上是顯著的,其中S(b1)是斜率的不確定度,t0.95,n-2是95%置信度,n-2自由度下的臨界t值。經計算|b1|

表3 柚皮素標準物質長期穩定性檢驗結果

2.4.2 短期穩定性檢驗結果短期穩定性數據的處理方式與長期穩定性一樣,采用t檢驗法來檢驗斜率b1的顯著性,從而評估短期穩定性。經計算在20、40、60 ℃下的|b1|均小于t0.95,n-2·S(b1)(表4)，表明在模擬運輸條件下柚皮素標準物質9 d穩定性良好。

表4 柚皮素標準物質短期穩定性檢驗結果

2.5 不確定度評定

根據《JJF1342-2012 標準物質定值的通用原則及統計學原理》[15]，標準物質總的不確定度包括以下3個方面：(1)樣品均勻性引入的不確定度uH；(2)樣品穩定性引入的不確定度us(包括長期穩定性不確定度ults和短期穩定性不確定度usts)；(3)樣品定值引入的不確定度uchar。標準物質的合成不確定度為：

(3)

2.5.1 均勻性引入的不確定度

2.5.2 穩定性引入的不確定度

2.5.3 定值引入的不確定度

(1)質量平衡法定值引入的不確定度：

質量平衡法定值的不確定度uMB計算公式如下：

(4)

其中：uMB、u(P0)、u(Xmoi)、u(Xele)、u(Xvola)分別為質量平衡法定值不確定度、液相色譜法測定主成分的不確定度、水分測定不確定度、無機雜質測定不確定度和殘留溶劑測定不確定度。

液相色譜法測定的不確定度主要由兩部分組成。分別為：(1)測定結果的重復性引入的不確定度u1,由多次測量的標準偏差計算；式中，Bimax為在6個檢測波長下雜質成分i的最大百分比含量;Bi定值λ為定值波長下的雜質成分i的百分比含量。(2)主成分和雜質最大響應波長差異引入的不確定度u2。

(5)

表5 不同波長下主成分和雜質的響應

(續表5)

Wavelength/nmImpurities contents/%Impurity 1(2.88 min)Impurity 2(3.41 min)Impurity 3(4.18 min)Impurity 4(8.16 min)Impurity 5(9.15 min)Impurity 6(10.91 min)2900.050.030.020.010.010.013000.120.030.020.040.020.083050.070.040.030.030.020.01310-0.020.020.040.020.01ui0.070.030.040.030.010.07u20.066 7

液相色譜法的合成不確定度為：

(6)

無機雜質和殘留溶劑的含量很少，因此主要考慮測量重復性引入的不確定度。無機雜質測定的不確定度u(Xele)為0.000 4%，殘留溶劑測定的不確定度u(Xvola)為0.001 0%。

因此，質量平衡法的標準不確定度：

(7)

(2)差示掃描量熱法引入的不確定度：

DSC法定值引入的不確定度uDSC分為A類不確定度和B類不確定度。A類不確定度由測量的重復性引起，用測量結果的標準偏差來計算。B類不確定度是儀器設備或測量條件等影響因素引入的不確定度。將ΔHf=Q·M/m代入公式(2)可得：

(8)

式中：x表示雜質的摩爾分數；R為氣體常數；T0和TS分別表示純樣品和實際樣品的熔化溫度；ΔHf表示摩爾熔化焓；Q為樣品熱焓；m為樣品質量；M為樣品摩爾質量;F為熔化了的樣品分數。

DSC法測量中的B類不確定度由以下公式計算：

(9)

式中，u(x)為雜質含量測定的偏差，u(Q)為銦標準物質的熱焓測定值與實際值的偏差，u(F)為熔融峰面積計算的偏差，u(TS)為銦標準物質熔點不確定度，u(m)為天平稱量和檢定的不確定度。

2.5.4 標準物質的合成及擴展不確定度下表所示為標準物質定值過程中各不確定度的分量，將其合并得到標準物質的總不確定度。

ParametersValue/%均勻性不確定度uH0.004 3長期穩定性不確定度ults0.006 1短期穩定性不確定度usts0.037 3質量平衡法定值不確定度uMB0.069 0差示掃描量熱法定值不確定度uDSC0.040 3

標準物質的合成不確定度：

(10)

擴展不確定度為：U=uC×k≈0.2%(k=2)。

3 結 論

本文以反相硅膠柱層析法純化得到柚皮素純度標準物質，采用質量平衡法和差示掃描量熱法進行定值分析。定值結果不確定度較低，表明質量平衡法和DSC法作為純度定值方法具有很高的準確性。柚皮素純度標準物質水分含量較高，可能由于烘箱干澡法效果不理想，可嘗試同時使用真空冷凍干燥。另外，采用卡爾費休法測定微量水分時，稱樣量的選擇要保證測量結果的均勻性。通過高效液相色譜法進行均勻性檢驗和穩定性考察，研制的柚皮素純度標準物質均勻性、穩定性良好，純度值為99.2%，擴展不確定度U=0.2%(k=2)，有效期為6個月。該標準物質對于柚皮素樣品分析檢測結果的準確性、量值溯源和量值傳遞具有重大意義。