離線二維色譜結合糖苷外切酶酶解用于IgG與人血清糖蛋白中N-糖鏈的結構表征

李 鳳，張含智，康經武

(1.西安文理學院 化學工程學院，陜西 西安 710065；2.上海市食品藥品檢驗所,上海 201203；3.中國科學院上海有機化學研究所 生命有機化學國家重點實驗室，上海 200032)

蛋白質糖基化是一類重要的翻譯后修飾過程，糖蛋白中的糖鏈結構不僅影響蛋白質的性質，如折疊、穩定性和溶解性等，還在細胞識別、信號轉導、細胞粘合以及免疫應答等多種細胞過程中具有重要作用[1]。在這些糖蛋白中，N-糖鏈的還原端通過糖肽鍵連接到肽鏈的天冬酰胺(Asn)殘基上，而O-糖鏈連接到肽鏈的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基上。免疫球蛋白是血清中高豐度的糖蛋白，也是一類重要的免疫效應分子。人體血清中抗體的主要成分——免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)由兩條重鏈和兩條輕鏈組成[2]。糖鏈對抗體的穩定性至關重要，可調節或者協調抗體的功能以及生物活性[3]，通過優化重組單克隆抗體(Monoclonal antibody，MAb)糖基化作用來改善藥效是一個重要的研究領域[4]。研究表明自身免疫性疾病以及癌癥中IgG糖基化發生改變的原因對理解這類疾病的分子發生機制，以及尋找合適的藥物靶標都非常有意義[5]。

血清作為人體最重要的體液，在臨床診斷和疾病的監控中應用廣泛，其中糖蛋白的糖基化與疾病的發生和發展密切相關[6]。目前，基于抗體的免疫化學測試在癌癥的診斷和監測中應用較為廣泛，如卵巢癌的CA125，乳腺癌的CA19-9或者CA15-3等[7]。但這些測試在癌癥早期檢測中的特異性和靈敏度均較差，仍需尋找與疾病密切相關的糖鏈應用于臨床[8]。因此，建立糖蛋白中糖鏈的分析方法對尋找與疾病相關的生物信息具有重要的現實意義。Callewaert教授利用DNA測序儀建立了糖蛋白中N-糖鏈的分析平臺，發展了GlycoirrhoTest方法應用于慢性肝臟疾病的診斷，該方法的特異性為86%，敏感性為79%，與臨床Fibrotest診斷方法相結合則可將特異性提高到100%[9]。Rudd教授與Waters公司合作建立的高效、自動化糖分析平臺，也成功應用于臨床人血清樣品生物標志物的研究中。分析發現，與正常組相比，乳腺癌患者血清樣本的N-糖鏈唾液酸化程度、分支結構以及巖藻糖化程度明顯增加[10]。

糖蛋白N-糖鏈常用的分離鑒定方法包括液相色譜、毛細管電泳(CE)、質譜及其聯用技術等[11-13]。其中CE具有分離效率高、樣品消耗少等優點，在復雜糖鏈結構表征中具有很大的應用潛力。Guttman課題組長期致力于將CE應用于糖鏈的結構分析中，實現了糖蛋白類抗體藥物N-糖鏈的結構鑒定[14]。王文波等利用毛細管電泳對原研抗CD20人鼠嵌合單抗和4個生物類似藥的N-糖鏈進行分析[15]。本課題組將激光誘導熒光毛細管電泳(CE-LIF)用于中藥多糖中單糖組成的定性定量分析，并建立了人血清N-糖鏈的指紋圖譜[16]。但對于復雜的生物樣本，蛋白種類繁多，動態范圍極廣，對低豐度的糖蛋白N-糖鏈進行結構分析困難較大。本文采用離線二維色譜，將弱陰離子交換色譜與CE-LIF相結合，實現了不同唾液酸化程度的N-糖鏈的分離。并將糖苷外切酶測序分別應用于中性N-糖鏈和不同唾液酸化程度N-糖鏈的結構鑒定中，最終確定了IgG的18種糖型。將其應用于人血清中N-糖鏈的指紋圖譜結構分析，發現人血清中的主要中性N-糖鏈與IgG中的中性N-糖鏈結構非常類似，同時發現人血清中含量最豐富的是含有兩個唾液殘基的糖鏈，其中兩天線的N-糖型FA2G2S2含量最高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ CE系統配LIF檢測器(美國Beckman Coulter公司)，激發波長488 nm，發射波長520 nm。Agilent 1260液相色譜系統配有紫外光度檢測器(VWD)和熒光檢測器(FLD)；Agilent 7820A氣相色譜儀。彈性石英毛細管柱50 μm i.d.，360 μm o.d.(Polymicro Technologies，USA)；聚乙烯醇(PVA)中性涂層毛細管柱(實驗室自制)。

肽N-糖苷酶F(PNGase F)試劑盒、唾液酸酶、β1-4 半乳糖苷酶購于美國紐英倫生物技術有限公司(New England Biolabs，USA)。α-L-巖藻糖苷酶(來源于牛腎)、免疫球蛋白G(IgG)、正常人血清、甲酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(DTT)、二甲亞砜(DMSO)、三乙胺、甲酸、乙酸(HAc)、三氟乙酸(TFA)、聚乙二醇(Mw20000)、聚乙烯醇(PVA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、葡聚糖混合物(Dextran ladder)、1 mol/L 氰基硼氫化鈉溶液(溶劑為四氫呋喃)、氰基硼氫化鈉(Na2BH3CN)、聚酰胺固相萃取小柱(DPA-6S)、胎球蛋白(Fetuin)購自于Sigma-Aldrich。 Sep-Pak C18固相萃取小柱購自Waters。多孔石墨化碳柱(Graphitized carbon cartridge,PGC小柱)購自Grace 。8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS)購于美國Invitrogen。APTS標記的葡聚糖混合物(Glyko?APTS-(Maltodextrin Ladder))購自Agilent。乙腈、甲醇、超濾管(0.5 mL，3 kDa MWCO)購自美國Merck。實驗用水為18 MΩ·cm超純水(Millipore超純水系統，美國Millipore公司)。所有溶液使用前需用0.22 μm濾膜過濾。

1.2 樣品前處理

1.2.1 N-糖鏈的制備由于N-糖鏈與蛋白質的天冬酰胺殘基連接，需將其從糖蛋白上酶解后再進行分析。IgG酶解方法如下：在100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液(含有5 mmol/L DTT)中配制IgG糖蛋白溶液(蛋白質量濃度為1 mg/mL)，于100 ℃和25 ℃交替加熱20 s，重復6次；冷卻至室溫，加入 2 μL(1 000 U)PNGase F酶，于37 ℃水浴酶解過夜，真空離心，濃縮至干備用。人血清樣品酶解方法如下：首先用3 kDa 超濾管處理去除血清樣品中的低分子量組分，然后將人血清樣品5 μL(蛋白質量濃度 10 mg/mL)參考PNGase F試劑盒的操作流程進行如下處理，首先加入10 μL 2% 十二烷基苯磺酸鈉(SDS)于60 ℃下孵育10 min，依次加入5 μL 4% 乙基苯基聚乙二醇(NP-40)以及2 μL PNGase F，37 ℃水浴酶解過夜。加入一定體積的預冷乙醇，使乙醇最終含量為75%，混勻后于-20 ℃靜置0.5 h，13 400 r/min離心15 min。取上清液，真空離心，濃縮至干備用。

1.2.2 N-糖鏈的純化酶切后的樣品溶于0.5 mL 5%(體積分數，下同)乙腈(含0.1% TFA)中，通過PGC小柱純化N-糖鏈：固相萃取柱先用 4 mL 80%乙腈(含0.1% TFA)活化，上樣后用2 mL 5%乙腈(含0.1% TFA)沖洗，最后用1.0 mL 40%乙腈(含0.1% TFA)洗脫樣品，回收洗脫液，真空離心，濃縮至干備用。

1.2.3 N-糖鏈的熒光衍生2-氨基苯甲酰胺(2-AB)熒光衍生：用DMSO-HAc(7∶3，體積比)配制50 g/L 2-AB和60 g/L NaBH3CN混合溶液，取5 μL該混合溶液加入樣品中，于37 ℃放置過夜后完成衍生反應。

APTS熒光衍生：用15%(體積分數)乙酸配制20 mmol/L的 APTS溶液，在糖鏈樣品中加入2 μL該APTS溶液以及2 μL 1 mol/L NaBH3CN的四氫呋喃(THF)溶液，于37 ℃放置過夜后完成衍生反應。

1.2.4 衍生后N-糖鏈純化2-AB和APTS衍生后的樣品均可通過固相萃取小柱DPA-6S純化。先用 4 mL 95%乙腈平衡小柱，上樣后用95%乙腈(含50 mmol/L三乙胺)沖洗，最后用1 mL 50 mmol/L三乙胺水溶液洗脫樣品，回收洗脫液，真空離心，濃縮至干備用。

1.2.5 熒光標記N-糖鏈的酶切將從50 μg蛋白樣品(IgG或人血清)中制得的N-糖鏈以HPLC分離，得到不同唾液酸程度的組分。APTS熒光標記并純化后，離心濃縮干燥，溶解在50 μL 50 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(pH 5.5)中，依次加入2 μL唾液酸酶、2 μLα-L-巖藻糖苷酶、2 μLβ1-4 半乳糖苷酶進行單一或混合酶切，酶切后的樣品真空離心濃縮至干，加入50 μL超純水溶解后，進行CE-LIF分析。

1.3 PVA 涂層柱的制備

配制6% PVA溶液，超聲脫氣10 min。截取4 m，50 μm i.d.的毛細管柱，在氮氣作用下，向毛細管柱通入6% PVA溶液，持續2 h，然后去除未與毛細管表面結合的PVA，最后將其置于氣相色譜儀的恒溫箱中，以5 ℃/min的速率程序升溫至145 ℃，保持5 h。

1.4 CE條件

PVA涂覆毛細管柱50 cm(有效長度39.5 cm)；分離電壓：20 kV；壓力進樣：0.3 psi×5 s；柱溫為25 ℃；背景電解質為25 mmol/L 乙酸銨(pH 4.75)和0.4% PEG 20000。

1.5 HPLC條件

色譜柱為Asahipak ES-502N(7.6 mm×100 mm，9 μm)；流動相：A為20% 乙腈水溶液，B為含250 mmol/L 甲酸銨(pH 4.5)的20%乙腈水溶液。梯度洗脫：0～10 min，2.5% B；10～36 min，2.5% ～67.5% B。流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；熒光檢測，激發波長為330 nm，發射波長為420 nm。

2 結果與討論

2.1 IgG中N-糖鏈的結構分析

2.1.1 離線二維色譜鑒定IgG的唾液酸化程度本文采用離線二維色譜的分離模式。第一維是弱陰離子交換色譜(Anion exchange chromatography，AEC)，選用Asahipak ES-502N色譜柱，以親水性聚乙烯醇為載體基質，表面鍵合二乙胺乙基官能團，通過鹽的梯度洗脫將所有N-糖鏈按照所含唾液酸的個數(0～4)進行分離;對相同唾液酸個數的組分，分別制備后，進一步通過APTS熒光衍生進行第二維的CE-LIF分析。由于糖鏈進行CE-LIF分析前，需采用APTS進行熒光衍生，而衍生試劑含有4個磺酸根，與弱陰離子交換色譜分離模式不兼容，可通過以下操作解決：(1)先用中性衍生試劑2-AB熒光衍生，對色譜條件進行優化，確定最優條件下不同唾液酸糖鏈的保留時間；(2)未衍生的糖鏈以上述相同的色譜條件進行分離，按照已確定的保留時間窗口制備得到不同唾液酸程度的糖鏈產品；(3)制備的糖鏈經過反相C18固相萃取小柱脫鹽后，以APTS熒光衍生，再進行CE-LIF分離。在色譜條件優化時，以標準糖蛋白胎球蛋白(Fetuin)N-糖鏈的唾液酸個數為參考標準進行IgG中N-糖鏈的歸屬。

圖1 弱離子交換色譜分析IgG中N-糖鏈熒光衍生產物

圖2 CE-LIF分離不同唾液酸化程度的IgG的N-糖鏈

如圖1所示，以Fetuin中N-糖鏈的保留時間為參考標準歸屬IgG糖鏈的唾液酸化程度。實驗發現，IgG中含量最豐富的是中性糖鏈(占總量的90%)，同時也含有少量單唾液酸(Monosialylated，S1)以及二唾液酸(Disialylated，S2)的糖型。對不同唾液酸程度的N-糖鏈進行制備，熒光衍生后進行CE-LIF分析。如圖2所示，制備后各組分的熒光強度明顯上升，有利于后續采用糖苷外切酶酶切測序進行結構鑒定。

2.1.2 CE-LIF結合糖苷外切酶酶解鑒定IgG的糖型糖蛋白N-糖鏈中的常見組成單糖類型包括甘露糖(Man)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖(Gla)、巖藻糖(Fuc)和唾液酸(Sia)。同時所有N-糖鏈都有一個由3個甘露糖和2個N-乙酰葡萄糖胺組成的核心五糖結構，即GlcNAc2Man3。N-糖鏈的結構解析選擇針對不同單糖、不同糖苷鍵特異性的糖苷外切酶酶切進行，通過建立酶陣列分析即利用CE-LIF測定依次特異性切除單糖后剩余的寡糖結構，實現自上而下的酶解消化(Top-down digestion)。具體而言，就是對去除端部單糖(如唾液酸、巖藻糖、半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖)后得到的糖鏈進行CE-LIF分析，重復上面的過程直至只剩下核心五糖結構。通過比較分析酶切前后所有的CE譜圖，考察酶切引起的色譜峰遷移時間的改變，將整個糖鏈結構進行重建實現自下而上的結構歸屬(Bottom-up identification)。

如圖3所示，對IgG中的中性糖鏈進行結構歸屬。采用上述分析策略，以β1-4半乳糖苷酶和α-L-巖藻糖苷酶進行單一或混合酶切。結果表明，兩種酶完全酶切后，分別得到含量稍高的兩天線型N-糖鏈以及平分型GlcNAc的N-糖鏈(圖3d)。實驗發現，從核心巖藻糖兩天線的糖型FA2G2中去除α1-6巖藻糖引起的葡萄糖單元數(即GUs值)變化為1.08，而從類似糖型FA2BG2中去除α1-6巖藻糖引起的GUs值變化為0.89。這是由于在CE分離中，酶切前后GUs的變化除與酶切去掉的單糖個數有關，還與糖鏈的主體結構密切相關，因為寡糖的電泳淌度由待分析物的流體力學體積所決定[17]。

在鑒定中性N-糖鏈結構的基礎上，進一步對單唾液酸組分進行分析，發現其最主要的組分是FA2G2S1和含有分叉型GlcNAc的類似物。其中FA2[3]G1異構體的含量相對較高，而中性組分中這類糖型的含量相對較低(圖3A，a;圖4)。文獻發現，IgG中α1-6連接的甘露糖殘基與CH2結構域的多肽存在較強的相互作用，而α1-3的甘露糖延伸至重鏈以外的空間[18]。所以α1-3天線的半乳糖發生唾液酸化更有利，蛋白更加穩定。采用bottom-up策略對單唾液酸糖鏈組分和二唾液酸糖鏈組分進行歸屬(圖4)，結果顯示其主要含有的糖鏈類型是FA2G2S3以及FA2BG2S3。

圖3 糖苷外切酶測序分析IgG中性糖鏈的CE-LIF色譜圖(A)和結構示意圖(B)

圖4 CE-LIF結合外切酶測序分析單唾液酸(A)和二唾液酸(B)IgG的N-糖鏈

圖5 IgG中18種糖型的CE-LIF色譜圖

圖6 弱陰離子交換色譜分析人血清中N-糖鏈

相比于親水相互作用色譜(HILIC)方法，CE-LIF可以較容易地實現異構體FA2[6]G1與FA2[3]G1的分離。可能是因為，HILIC的主要分離原理是基于待分析物的親水性差別，而CE-LIF的分離效果與待分離組分的流體力學體積相關，可以更好地實現異構體的分離[10]。通過將離線二維色譜與糖苷外切酶測序相結合，CE-LIF方法共分離鑒定了IgG中的18種糖型(圖5)，所鑒定的糖型包括Wuhrer課題組討論的IgG中常見的16種糖型，證明該方法與文獻報道的結果較一致[19]。與色譜-質譜聯用技術相比，部分含量較低的高甘露糖糖型未被鑒定，說明本方法的靈敏度還有待進一步提高[20]。但基于毛細管電泳的方法成本更低，容易實現高通量檢測，在生物制藥行業具有重要的應用潛力。

2.2 離線二維色譜鑒定人血清中N-糖蛋白的唾液酸化程度

將離線二維色譜與糖苷外切酶分析相結合，對CE-LIF分離得到的人血清電泳圖中的N-糖鏈進行結構歸屬。先通過弱陰離子交換對血清中的N-糖鏈進行制備，分別得到Neutral、S1、S2、S3以及S4 5個組分的糖鏈混合物，其組分內具有相同的唾液酸化程度(圖6)。5個組分間唾液酸化程度糖鏈的相對量為S1∶S2∶S3∶S4=4.7∶20.9∶6∶1。對這5個組分唾液酸酶酶切前后的情況進行CE-LIF分析(圖7)，并以IgG中N-糖鏈作為標準，對CE-LIF中豐度較高的組分進行結構歸屬，發現其中含量最高的是FA2G2S2。實驗發現人血清糖蛋白的中性N-糖鏈結構與IgG非常類似，這與文獻報道的IgG是人血清中含量最高的免疫球蛋白一致[17]。

圖7 CE-LIF分析人血清中不同唾液酸化程度的N-糖鏈

3 結 論

本文將弱陰離子交換色譜以及毛細管電泳的二維分離平臺應用于IgG以及人血清中N-糖鏈的結構鑒定。采用“bottom-up”的策略對IgG中的糖鏈結構進行鑒定，發現酶切前后GUs的變化即寡糖的電泳淌度，與糖鏈的流體力學體積密切相關。通過將離線二維色譜與糖苷外切酶測序結合，采用CE-LIF共分離鑒定了IgG中18種糖型。將上述策略進一步應用于人血清中N-糖鏈的分析，發現不同唾液酸化程度糖鏈的相對量為S1∶S2∶S3∶S4=4.7∶20.9∶6∶1。同時，研究表明人血清中含量最豐富的是二唾液化的糖型，其中兩天線的FA2G2S2含量最高。本文實現了人血清中N-糖鏈指紋圖譜的初步結構分析，在發現糖蛋白類生物標志物中具有較大的應用潛力。