基于銅/銀納米簇檢測銅離子的方法研究

孫亞蘭，蔡伊娜，任冰雪，彭池方,*

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.深圳海關 食品檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045)

銅是人體內含量第三的金屬元素，但攝入過量的銅離子(Cu2+)也會影響人體機能，損傷器官[1-2]。因此，對環境和食品中Cu2+的檢測受到關注。目前，Cu2+的檢測方法主要有原子吸收光譜法(AAS)[3]、共振散射光譜法[4]、電感耦合等離子體質譜法[5]等，但這些方法需專業人員操作,成本高。因此，開發操作簡單、成本低廉的Cu2+檢測方法具有重要的應用價值。

近年來，金屬納米簇以其低毒性、高熒光強度和良好的生物相容性引起了人們的極高興趣。至今，已有多種金屬納米簇(包括金、銀、銅等)在細胞成像、醫療診斷、小分子檢測和離子檢測等領域得到廣泛應用[6]。同時，人們還發現雙金屬納米簇(NCs)，如Au/AgNCs[7]、Cu/AgNCs[8-9]等也具有許多優異的特性。Li等[9]利用DNA-Cu/AgNCs建立了一種高靈敏度的乙酰膽堿酯酶檢測方法，該法檢測乙酰膽堿酯酶的線性范圍為0.05～2.0 mU/mL，檢出限為0.05 mU/mL。

與傳統熒光材料相比，金屬納米簇的熒光強度相對較弱，因此，增強納米簇的熒光強度也是研究者關注的重點之一。2010年，Martinez課題組[10]通過DNA分子雜交將富含鳥嘌呤(Guanine，G)的DNA序列放置在DNA-AgNCs附近，發現DNA-AgNCs的熒光增強了500倍。Li等[11]通過“TTTTT”環將含G序列的適配體與合成銀納米簇的DNA序列直接連接，利用連接后的核酸序列作為模板DNA合成了熒光增強型的AgNCs，并將DNA-AgNCs應用于細胞成像中。在此基礎上，Wang等[12]提出G-四聯體可以作為DNA模板的一部分，尤其是作為C3A(CCCA)結構的DNA模板的一部分合成熒光增強型的DNA-AgNCs。綜上所述，將G堿基插入到鄰近C序列的位置時會使AgNCs出現熒光增強現象。Guo等[13]發現，當將G堿基插入到連續的C序列模板中間位置時也可使AgNCs出現熒光增強現象。而雙金屬Cu/Ag納米簇(Cu/AgNCs)是否存在G堿基鄰近或插入增強效應尚未見報道。

本文選擇常見的富C堿基序列制備DNA-Cu/AgNCs，探究了鄰近或插入G堿基序列對的DNA序列對DNA-Cu/AgNCs的熒光增強效應，以及對不同金屬離子的選擇性；并基于此建立了快速高靈敏的Cu2+熒光檢測新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(UV-2802pcs，優尼柯公司)；高分辨透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本電子株式會社)；分析天平(MS105DU，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；熒光分光光度計(F97Pro，上海棱光技術有限公司)。

硝酸銅(Cu(NO3)2)、硝酸銀(AgNO3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、硫酸鎳(NiSO4)、硝酸鋁(Al(NO3)3)、氯化錳(MnCl2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、硝酸鋅(Zn(NO3)2)溶液和硝酸汞(Hg(NO3)2)、硼氫化鈉(NaBH4)均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨酸、5-嗎啉丙磺酸(MOPS)、九水合硝酸鐵(Fe(NO3)3·9H2O)、六水合硫酸鎳(NiSO4·6H2O)、九水合硝酸鋁(Al(NO3)3·9H2O)、四水合氯化錳(MnCl2·4H2O)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O)、硝酸汞(Hg(NO3)2)均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為Millipore制備的18.2 MΩ·cm的超純水。

相關的DNA序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成，7條不同模板DNA序列見表1。

表1 制備銅/銀納米簇的DNA模板序列

1.2 DNA-Cu/AgNCs的制備

DNA-Cu/AgNCs的合成方法根據文獻[14]方法稍作調整，具體如下：將45 μL AgNO3(1.0 mmol/L)、45 μL Cu(NO3)2(1.0 mmol/L)和10 μL不同序列的DNA(500 μmol/L)模板加入到90 μL磷酸鹽緩沖液(40 mmol/L，pH 7.0)中混合均勻，然后置于冰浴中孵育15 min后立即加入30 μL NaBH4(2.0 mmol/L)，置于暗處，室溫下孵育9.0 h。將所得DNA-Cu/Ag NCs溶液置于4 ℃下保存待用。

1.3 選擇性分析

分別配制20 μmol/L的硝酸鐵(Fe(NO3)3)、硫酸鎳(NiSO4)、硝酸鋁(Al(NO3)3)、氯化錳(MnCl2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、硝酸鋅(Zn(NO3)2)和硝酸汞(Hg(NO3)2)溶液。取上述金屬離子溶液各50 μL，分別與50 μL DNA-Cu/AgNCs溶液室溫下孵育15 min后測定熒光發射光譜。

1.4 銅離子(Cu2+)檢測方法

首先將30 μL NaBH4(100 μmol/L)與20 μL汞離子(5.0 μmol/L)(含不同濃度銅離子)溶液室溫下混合均勻并孵育20 min，屏蔽汞離子。取用MOPS緩沖溶液(10 mmol/L，pH 8.0)稀釋2 000倍的DNA-Cu/AgNCs溶液30 μL，與20 μL上述含不同濃度銅離子的溶液室溫下孵育15 min,取該孵育后溶液100 μL加入石英比色皿，檢測反應液在500 nm激發波長處的熒光發射光譜。

1.5 樣品分析

收集實驗室的自來水和湖水(取自無錫太湖)進行加標回收實驗。在自來水樣品中加入不同濃度(0.2、2.0、5.0 μmol/L)的Cu2+，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得到用于檢測的加標自來水樣品。按照“1.4”方法測定加標樣品的熒光發射光譜并計算回收率。類似地，在湖水中分別加入濃度為1.0、10.0、25.0 μmol/L的Cu2+，經微孔濾膜過濾，用超純水稀釋5倍，按上述方法測試計算。

2 結果與討論

2.1 DNA-Cu/AgNCs的制備與表征

根據Guo等[13]的研究得知，在DNA模板中鄰近C堿基的位置添加G堿基可以增強銀納米簇熒光，由此，本文設計了3種在C堿基鄰近位置添加G堿基的方式，共得到7條不同序列，編號2～8，對照模板為合成銀納米簇的常用模板，編號為1，如表1所示。

圖1 DNA1-Cu/AgNCs～DNA8-Cu/AgNCs的熒光光譜圖

將使用DNA1～8合成的DNA-Cu/AgNCs分別編號為DNA1-Cu/AgNCs～DNA8-Cu/AgNCs，由熒光光譜圖(圖1)可見，DNA1-Cu/AgNCs在最大激發波長為472 nm時，最大發射波長為566 nm；DNA2-Cu/AgNCs在最大激發波長為500 nm時，最大發射波長為583 nm；DNA3-Cu/AgNCs～DNA8-Cu/AgNCs在最大激發波長為465～469 nm時，最大發射波長為550～560 nm；其中，DNA2-Cu/AgNCs相對于使用對照模板合成的銅/銀納米簇(DNA1-Cu/AgNCs)來說，不僅最大發射波長紅移了17 nm，而且在最大發射波長處的熒光強度顯著增強，這也與之前報道的將G序列插入C堿基的鄰近位置會導致銀納米簇熒光增強的結果一致[12]。

如圖2A所示，DNA2-Cu/AgNCs的紫外吸收光譜僅在262 nm處有最強吸收峰，這表明所制備的納米簇顆粒尺寸超小；而在最大激發波長500 nm下，DNA2-Cu/AgNCs于583 nm處有最強吸收峰。由圖2B可知，DNA2-Cu/AgNCs的粒徑約3.0 nm，在水溶液中呈均勻分散狀態。由圖2C可見,DNA2-Cu/AgNCs主要由C、N、O、P、Cu、Ag 6種元素組成，其中Cu元素含量顯著高于Ag元素；元素面掃描分析(圖2D)也與此結果一致。

2.2 選擇性分析

為了考察DNA2-Cu/AgNCs對Cu2+檢測的選擇性，研究了該方法對常見的10種金屬離子(Fe2+、Ni2+、Al3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、 Hg2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+)的響應。結果如圖3A所示(IF0為初始熒光強度,IF為加入Cu2+的熒光強度)，10 μmol/L的其他陽離子對反應體系的熒光強度無顯著影響，而1.0 μmol/L的Hg2+和10 μmol/L的Cu2+使DNA-Cu/AgNCs的熒光強度明顯猝滅。說明該納米簇對Hg2+和Cu2+均存在響應。為了實現對Cu2+的高選擇性測定，探討通過Hg2+的屏蔽來實現單一離子的檢測。如圖3B所示，5 μmol/L的NaBH4使被Hg2+猝滅的DNA2-Cu/AgNCs熒光強度得到完全恢復。已有研究表明，AgNCs表面存在許多Ag+，而Hg2+與Ag+之間存在強烈的親金屬作用。因此，推測Hg2+對DNA-Cu/AgNCs的猝滅效應主要來自Hg2+與Ag+之間的親金屬作用。NaBH4可將Hg2+快速還原為Hg0，這將破壞Hg2+與Ag+之間的親金屬作用[14]，使DNA2-Cu/AgNCs的熒光恢復。

如圖3C所示，對比a、b、c和d 4組實驗，發現NaBH4可以使DNA2-Cu/AgNCs被Hg2+猝滅的熒光得到恢復。e與f組實驗結果一致，說明掩蔽劑可以屏蔽Hg2+的影響。同時，NaBH4對Cu2+的檢測也基本無影響(圖3C中f、g)。上述結果表明，NaBH4可以在此傳感體系中作為Hg2+的掩蔽劑。

圖2 DNA2-Cu/AgNCs的熒光光譜與紫外吸收光譜(A)、TEM圖(B)、EDX譜圖(C)及元素面掃描圖(D)

圖3 檢測方法對不同金屬離子的選擇性(A)、不同濃度的NaBH4對Cu2+檢測的影響(B)以及不同反應體系對DNA2-Cu/AgNCs熒光性能的影響(C)

Fig.3 Selectivity of the assay for different metal ions(A)，effect of NaBH4on Cu2+detection(B) and effect of different reaction system on the fluorescence intensity of DNA2-Cu/AgNCs(C)cHg2+:1.0 μmol/L,cother ions:10 μmol/L;NCs:DNA2-Cu/AgNCs

圖4 EDTA對DNA2-Cu/AgNCs(NCs)熒光的影響

2.3 Cu2+與DNA-Cu/AgNCs之間的作用

由圖4可見，DNA2-Cu/AgNCs的熒光被Cu2+猝滅后加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，其熒光強度可基本恢復；而EDTA對DNA2-Cu/AgNCs的熒光強度僅有較小影響。因此推測，Cu2+對于納米簇的熒光猝滅主要是通過核酸模板分子的絡合作用而發生。研究顯示，鳥嘌呤(G)可由其N7和O6原子以及胞嘧啶(C)上的N3和O2原子與Cu2+發生絡合作用[15]。另外，在DNA2-Cu/AgNCs的熒光被Hg2+猝滅后加入EDTA，其熒光強度無任何變化(圖e，f)。上述實驗結果表明,Hg2+主要通過和Ag+間的親金屬相互作用導致納米簇熒光猝滅。由于EDTA對Hg2+的絡合作用難以破壞Hg2+-Ag+鍵合作用，因此納米簇熒光難以恢復。

2.4 Cu2+熒光檢測的條件優化及標準曲線

為了提高DNA2-Cu/AgNCs檢測Cu2+的靈敏性，對實驗條件進行了優化。確定DNA2-Cu/AgNCs與Cu2+溶液的最適孵育時間為15 min，DNA2-Cu/AgNCs的最適稀釋倍數為2 000倍(圖5A,B)。在最優反應條件下，利用NaBH4掩蔽Hg2+，Cu2+濃度(x)在0.01～5.0 μmol/L范圍內與熒光猝滅率IF/IF0(y)呈現良好的線性關系，線性方程為y=0.740 17-0.084 77x，r2=0.982 55，最低檢出限為5.0 nmol/L(根據3σ/s計算，其中σ為空白對照的標準偏差，s為指線性方程的斜率)。該方法的檢出限遠低于《生活飲用水衛生標準》(GB 5749-2006)中規定的Cu2+的限量1.0 mg/L(15.6 μmol/L)。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法測定自來水和湖水樣品中的Cu2+含量并與原子吸收光譜(AAS)方法測定結果進行比較，同時對實驗室的自來水進行0.2、2.0、5.0 μmol/L 3個水平的加標實驗，對湖水進行1.0、2.0、5.0 μmol/L 3個水平的加標實驗，結果如表2所示。該方法對Cu2+的回收率為89.6%～107%，相對標準偏差(RSD)為2.7%～8.6%，表明該方法具有良好的準確性和重復性。

表2 自來水和湖水樣品中Cu2+的檢測(n=3)

(續表2)

SampleAdded(μmol/L)Found(nmol/L)Recovery(%)RSD(%)AAS(μmol/L)Lake water0239.0--223.71.0964.396.47.9 -2.02 1081055.3 -5.05 3101065.4-

3 結 論

基于雙金屬DNA-Cu/AgNCs存在的G堿基鄰近增強效應以及由此產生的對Cu2+的特異性響應，建立了測定Cu2+的熒光傳感方法。該方法的線性范圍為0.01～5.0 μmol/L，檢出限低至5.0 nmol/L。方法可用于實際樣品檢測，且具有簡單快速、選擇性高、成本低等優點。