水產品真偽鑒別與產地溯源檢測研究進展

陳柔含，古淑青，鈕 冰，鄧曉軍

(1.上海大學 生命科學學院 食品工程系，上海 200444；2.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135)

水產品是世界上貿易最多的食品，隨著人類對食物質量要求的日益增高，大西洋鮭魚、鱈魚等高值水產品的消費量逐年增大，在水產品的種類、來源、養殖方式、運輸、加工、包裝、標簽等各個環節發生食品欺詐的概率也越來越高[1]。低值水產品冒充高值水產品，錯誤標簽原產地，錯誤標記成分及成分比例等時有發生，不僅影響了消費者安全和權益，而且影響了整個食品工業發展。目前各個國家和國際組織已經制定了許多法規來防止摻假和食品標簽的錯誤標識，水產品必須有“可追溯標簽”，不得誤標物種信息[2]。

圖1 水產品真偽鑒別和溯源檢測的分析方法

準確、可靠的分析方法是確定食品標識是否真實的前提。傳統方法主要通過形態學方法判別新鮮或者未經加工的冷凍水產品，但無法辨認相似水產品及精加工制品，這就需要更加準確可靠的分析方法對食品真實性進行監測和控制。目前水產品真偽鑒別與溯源檢測的常用方法主要有光譜、核磁共振(NMR)、酶聯免疫(ELISA)、核酸檢測、電泳、色譜及質譜等技術(如圖1所示)。光譜技術能夠快速、環保、無創地對肉制品進行光譜和空間成像，但受限于光譜范圍和水分含量，且成本較高[3]。ELISA法可針對抗原抗體特異性結合并發生顯色反應，但無法高通量檢測，且假陽性概率高。核酸檢測技術能直接從基因層面鑒別，但加工過程易使DNA變性損失。電泳法可對樣品進行分離純化和鑒定，但重現性較差。色譜法定性分析較弱。而質譜(MS)法可給出化合物的分子結構信息，在食品檢測中的應用越來越普及，已成為當前國際檢測領域中通用的“金標準”。目前，基于質譜的水產品鑒偽和溯源已有較多研究，主要利用同位素比值差異、小分子物質結構和含量差異以及蛋白質差異進行檢測分析[4-6]。其中，基于質譜的蛋白質組學技術是近年來廣泛關注的研究熱點，通過高效液相色譜、毛細管電泳等分離手段結合電噴霧(ESI)、基質輔助激光解析(MALDI)等不同類型的離子化技術檢測，在蛋白水平上進行物種鑒別和產地溯源。本文將就水產品鑒偽及溯源的最新研究進展進行論述。

1 水產品摻偽與溯源概況

摻偽主要包括摻假、摻雜和偽造。水產品摻偽主要指人為向水產品中非法摻入外觀、物理性狀或形態相似的物質以增加其重量或體積，或采用低值魚代替高值魚，如黑線鱈代替真鱈，虹鱒魚代替三文魚，巴沙魚標榜為龍利魚，從而降低成本獲取利潤[7]。長時間冷凍而皺縮的烏賊用水浸泡后恢復“新鮮”且有增重效果，小黃魚放置過久變暗，用黃鱔血或黃粉涂抹改善色澤等行為，通過故意摻水或添加非法添加劑進行摻偽。

溯源是水產品安全管理的一個重要手段，產地溯源是其重要組成部分，有利于保護消費者權益，保護地區特色產品，確保公平競爭，并且能夠在突發環境污染、疫病疫情等食品安全事件時，有效召回產品[8]。比如新西蘭南岸沿海和南極圈之間鱈魚資源豐富，生長環境好，因此該地產出的鱈魚純正、營養最佳，時有其他地區鱈魚冒充新西蘭鱈魚進行銷售，欺騙消費者?！瓣柍魏箝l蟹”、“波士頓龍蝦”、“阿拉斯加帝王蟹”等均屬于地域特色性水產。溯源技術的出現使得產品得到監管和保障，許多國家已經建立了相關可追溯體系及法律法規。

2 水產品真偽鑒別與溯源檢測方法

現代分析方法已經廣泛應用于水產品的真偽鑒別與溯源檢測方面，光譜法、ELISA及核酸檢測通過靶標物質鑒別真偽，電泳、色譜和質譜等方法具有強大的分離分析能力，在摻假檢測基礎上可進一步定量，而核磁共振及同位素質譜技術對水產品溯源具有很大幫助。

2.1 光譜法

基于振動光譜學的近紅外(NIR)和拉曼光譜(Raman spectroscopy)分別通過電磁輻射吸收和拉曼散射測定分子振動信息得到光譜圖，結合高光譜(HSI)成像技術可以得到空間圖像信息，具有無損、快速和準確的優點，通常用于食品認證和質量控制[9]。Alamprese等[10]用NIR法根據不同魚種的紅外吸收峰不同，準確鑒別了兩對相似的魚種，鯔魚和紅鰹、鰈和偏口魚。NIR結合HIS可用來區別新鮮和冷凍鱈魚片，但靈敏度較低，不適合做痕量分析[11]。Hikima等[12]開發了一種拉曼光譜法用于檢測鮭魚片中的蝦青素含量，通過計算蝦青素/(蛋白質和脂肪)的相對強度比值能有效區分大西洋鮭、銀鮭和紅鮭。拉曼與近紅外光譜互為補充，可以鑒別特殊結構或特征基團，但在定性的準確性和定量的靈敏度方面有待于進一步提高。

熒光光譜是通過熒光標記氨基酸、核酸、NDAH和一些氧化產物，根據物種、地理來源和加工條件來評估魚類的新鮮度及類別[13]。

2.2 核磁共振波譜法

核磁共振波譜(NMR)法是將核磁共振現象應用于分子結構的測定，其原理是微觀粒子吸收不同能量的電磁波后可在不同能級上躍遷，從而表現出核磁共振譜圖的吸收峰位置、強度和精細結構不同。近年來高分辨核磁共振波譜儀的出現為食品中的代謝物提供了高通量光譜/結構信息。NMR法可借助分析有機物中13C、1H等元素來區分野生和養殖魚類，從而進行地理溯源[14-17]。法國阿基坦魚子醬久負盛名，常被其它產地的魚子醬冒用，Heude等[18]通過1H NMR對代謝物進行光譜分析，運用多變量統計模型對阿基坦魚子醬和意大利、中國、烏拉圭地區的魚子醬進行了區分。NMR法的最大優勢是能通過同分異構體得到物質結構式，且提供的原子層面信息遠大于紅外光譜，但該方法儀器價格昂貴，靈敏度較低。

2.3 酶聯免疫法

酶聯免疫(ELISA)法是通過將抗原或抗體固定化和酶標記，根據顏色反應來判定的分析方法。東大西洋石斑魚和多鋸鱸為兩種高值魚，Asensio等[19]采用間接法對餐館中的44個魚粉樣品進行ELISA檢測，發現29份樣品為假冒產品。Santaclara等[20]建立了多重PCR-ELISA方法，DIG標記后的PCR產物用于ELISA測定，出現藍綠色則為金槍魚，能有效將金槍魚與代替物種區分開來。此外，ELISA和電泳等方法可結合使用，Liang等[21]將ELISA和SDS-PAGE結合統計得出小清蛋白免疫反應強烈程度與其含量之間的相關性，并通過不同的小清蛋白特異性抗體來鑒別南半球魚的物種。

目前ELISA法已經發展成為商業試劑盒，具有很強的專一性，但無法進行高通量檢測，穩定性和重復性也較差，易發生交叉反應。

2.4 核酸檢測技術

DNA含生物體所有遺傳信息，基于核酸的分析技術能最本源地區分相似水產品。細胞色素C氧化酶I(COI)在不同魚種具有特異性，通過基因條碼COI建立可靠的DNA指紋圖譜可用于快速鑒偽[22-25]。Taboada等[26]開發雙重PCR-ELISA方法可正確鑒別3種不同類型鱈魚(Molvamolva、Gadusmorhua、Gaduschalcogrammus)。Molkentin等[27]用等電聚焦分離鮭魚水溶性蛋白質，PCR擴增分析有機、養殖和野生型鮭魚。Fernández-Pérez等[28]開發了基于5S rDNA和ITS區域的PCR-RFLP法鑒別4種歐洲斧蛤，方法高效、快速、簡單，對溯源具有一定參考價值。轉基因水產品也是摻假的一種，實時熒光定量PCR設計內源基因靶標來檢測DNA，而非轉基因樣品無檢測信號，從而做出可靠判斷[29]。可視芯片是一種利用特異探針雜交產生可見信號的基因芯片技術，韓建勛等[30]采用該技術建立了一種常見魚源性成分的高通量快檢方法，為標簽認證和魚肉溯源提供了快速、有效的技術支持。Rasal等[31]基于單核苷酸多態性(SNP)建立了二代測序高通量測序技術，得到22種魚類的遺傳差異并對其進行了準確分類。

核酸檢測技術關鍵是分析具有種間差異的可靠核酸片段，但高溫烹飪及干燥等加工過程會對DNA造成一定損失，需進一步探索。

2.5 電泳技術

電泳作為近現代高分辨分離技術，利用帶電粒子在電場中分離的原理，隨著基因組學、蛋白質組學的發展，凝膠電泳、雙向電泳、毛細管電泳技術應運而生，尤其是毛細管電泳已成為分離DNA片段的重要工具和首選方法[32]。毛細管電泳以毛細管為分離通道進行快速分配，其分析效率高，在蛋白分析中得到廣泛應用[33]。但毛細管電泳法的進樣量少、檢測光程短，可通過結合化學發光檢測提高方法的靈敏度[34-35]。Walker等[36]基于芯片的微流體電泳分析魚類肌肉蛋白并分類，能顯著區分鯰魚、鯛魚、石斑魚以及非法替代品，靈敏度、特異性和準確度均大于98%。

2.6 色譜技術

色譜主要是將各種化合物分離后進行定性、定量分析，常見的色譜技術包括氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)技術。水產品中通常含有大量脂質、脂肪酸(如ω-3脂肪酸、甘油三酯(TG))，常用反向高效液相色譜(RP-HPLC)來鑒別真偽[37]。油魚(Ruvettuspretiosus)油脂含量極高，且不被人體消化，不法商販用其替代鱈魚被消費者食用后易出現腹瀉等癥狀，Nichols等[38]采用氣相色譜和薄層色譜法對富含油脂魚類進行分析，發現其含有大量非皂化性脂質，對人體健康存在威脅。將色譜與質譜技術進一步聯用可提高靈敏度和準確性，從而實現精確定量。

2.7 質譜技術

2.7.1 基于同位素的質譜技術不同種類及來源的水產品同位素比值(δ)因受氣候、環境、生物代謝等因素影響而存在差異，因此，可借助同位素組成來鑒定水產品真偽與溯源。Carrera等[39]測定了13種主要商業鱈魚δ13C和δ15N，結果表明不同地理位置，其同位素比值存在差異。Gopi等[40-41]通過連續流質譜(CF-IRMS)得到δ13C和δ15N，可區分盲曹魚、斑節對蝦的產地來源，結合Itrax XRF區分養殖和野生捕獲的斑節對蝦，其準確度可達90%和95%。地理位置結合飼料喂養差異性也能精確溯源，Camin等[42]測定虹鱒魚中H、C、N、O和S同位素比值，量化地理和營養物質關系，可有效評估地理來源。由于各養殖場飼料組成不同，結合脂肪酸和同位素可以精確溯源[43]。Zhang等[44]采用同位素比質譜(IRMS)結合脂肪酸組成對不同采樣點的野生海參進行差異分析，以實現準確分類與溯源。將元素標記電感耦合等離子體質譜儀(FI-ICP-MS)用于檢測樣品中的蛋白質、多肽和脂肪酸，具有高靈敏度和選擇性，對保護地域特色物種具有重大參考價值[45-46]。

2.7.2 基于脂肪酸的質譜技術水產品中的脂肪含量很高且不盡相同。液相色譜-電噴霧串聯離子阱質譜法(LC-ESI-MS/MS)已廣泛應用于植物油中TG的結構解析，2010年有研究者[47]將該法應用于鱈魚肝油的鑒偽，通過TG分子基本結構特征及其碎裂機制來判別產品真偽。Black等[48]用快速蒸發離子化質譜(REIMS)實時檢測魚類的脂肪種類和含量確定物種，但儀器成本較高。GC-MS仍然是迄今為止用于分析脂肪酸的最常用和最可靠的方法，但由于脂肪酸的低揮發性易導致難以定量或靈敏度較差，需衍生為脂肪酸甲酯以便色譜分離。Borden等[49]用凝相薄膜導入質譜法(CP-MIMS)直接表征鮭魚組織中的脂肪酸，并添加了甲醇改性劑以提高對較長鏈脂肪酸的分析性能，對食品認證和營養分析具有重大意義。

圖2 LC-MS/MS(A)及MALDI-TOF MS(B)法檢測水產品真偽

2.7.3 基于蛋白質的質譜技術基于蛋白質組學的質譜技術已被廣泛用于食品質量認證，具有高通量、高靈敏度且不易受生產加工影響的優勢，按技術路線可分為“Bottom up”和“Top down”兩種。“Bottom up”也稱“鳥槍法”，其工作流程通常是胰蛋白酶酶解出特征肽段進入質譜分析[50-51]。液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)為常用分析方法，其步驟如圖2A所示，小清蛋白(RPVB)[52-54]、精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)[55]以及特異性蛋白[56-57]均可用作標記物來鑒別魚類和蝦類。“Top down”的蛋白質組學工作流程是將蛋白質提取物直接進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)分析，產生的高豐度蛋白質指紋通過與數據庫比對來鑒定屬和種，高效簡單，其原理如圖2B所示[58]。2013年，商業用MALDI-TOF MS在物種水平上對72個蝦樣本進行鑒定，準確率達到97%[59]。MALDI-TOF MS和PCR方法同時鑒定扇貝，兩者結果一致，但前者更高效、快速和準確，具有強大的發展前景[60]。MALDI-TOF MS還可根據魚眼玻璃體液[61]和肌肉組織[62]分析魚體新鮮度及加工方式。MALDI-TOF MS作為非選擇性檢測方法，可為每個樣品創建指紋和建立物種鑒別數據庫，有望能取代DNA測序成為最佳的物種鑒別方法[63]。

蛋白質定性有助于鑒定和表征樣品中全套蛋白質從而達到鑒別真偽的目的。食品加工和儲存過程造成蛋白質翻譯后修飾會影響其活性和穩定性[55]，如羰基化、美拉德反應、縮合反應等，具備特異性。兩種常見的蛋白質定性方法是肽質量指紋圖譜(PMF)和肽片段化指紋圖譜(PFF)，前者通過純化蛋白進入MS/MS檢測后產生的一種或多種肽段進行鑒定，而PFF則采用2-DE分離出未知蛋白質，酶解后進入質譜分析[64]。Barik等[65]通過2-DE結合 MALDI-TOF MS研究月尾鳠(Sperata seenghala)和劍鳠(Sperata aor)兩種相近諾鲿的肌漿肽差異，結果表明磷酸丙糖異構酶在兩種諾鲿中具有特異性，從而進行鑒別。Gerbig等[66]用解吸電噴霧電離質譜法(DESI-MS)分析歐洲5種常見錯誤標識魚(鱈魚、鮭魚等)的非揮發性代謝物并正確鑒別真偽。Nessen等[67]分析5種不同比目魚肌肉組織的酶解肽段碎片譜圖，并通過對比物種譜庫完成了物種鑒定。食品加工業中物種數據庫缺少，導致食物摻假事件發生，這就需要完善已有的數據庫。目前水產品相關數據庫主要有GPM、Uniprot、PRIDE、華大基因、Matrix Science、NCBI等。

蛋白質組學質譜法還可用來定量分析，篩選物種特征肽段在多反應監測掃描(MRM)模式下的量化摻假。Marchis等[68]通過選擇特征肽，建立LC-ESI-MS/MS方法在MRM下分析牛、豬、水產品和乳制品加工產品，可有效監測肉制品摻雜，最低檢測限為1 nmol/L。Hu等[69]則針對日本、中國和凡納濱產地對蝦，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UPLC-Q-TOF MS)選出3種蝦的特征肽作為定量肽段，其特征肽大多來自肌球蛋白、精氨酸激酶和血藍蛋白。Sun等[70]建立LC-MRM-MS/MS方法分析小清蛋白，發現了比目魚的小清蛋白特征肽段，據此可檢測不同食品基質中比目魚的含量，最低檢測限為0.02 μg/g，定量限為0.10 μg/g。

2.8 其他方法

傳感器作為水產品質量和真實性評估的新興方法，具有廣大的應用前景[71]。Handy等[72]結合DNA微陣列與中紅外成像，觀察雜交斑點并用拉曼光譜進一步表征，可正確識別7種鯰魚及其代替物種。Ulrich等[73]基于實時核酸序列依賴性擴增技術(RT-NASBA)設計手持傳感器，以線粒體16S rDNA基因區域來區分石斑魚和替代魚類，方法快速便捷。

表1～2分別列出了部分方法在水產品的真偽鑒別與溯源檢測方面的應用。

表1 水產品真偽鑒別方法

COI:cytochrome oxidase I,DIG:digoxin,PCR:polymerase chain reaction,RFLP:restriction fragment length polymorphism analysis,DESI:desorption electrospray ionization

表2 水產品溯源檢測的方法

PCA:principal component analysis;OPLS-DA:orthogonal projection on latent structure-discriminant analysis;ANOVA:analysis of the variance;δ13C:stable isotope ratios of C;FA:formic acid;LFQ:label-free quantitation;IRMS:isotope ratio mass spectrometer;CF-IRMS:continuous-flow isotope ratio mass spectrometer;PLS-DA:partial least squares-discriminant analysis;LDA:linear discriminant analysis;ICP-MS:inductively coupled plasma mass spectrometer;SVM:support vector machine

3 結論與展望

分析技術的發展促進了水產品真偽鑒別與溯源檢測技術的創新，保證水產品質量安全的需求也正成為分析方法提升的強大動力。色譜-質譜技術具有高穩定性、高靈敏度以及高通量的特點，能夠對特征組分進行準確鑒別和精確定量，日益成為水產品真偽鑒別和溯源檢測的核心，同其它分析技術相互補充，有力保障了水產品質量安全。但基于色譜-質譜技術的真偽鑒別和溯源研究也存在以下局限性，如：一般需要較為復雜的前處理過程以提純靶標物質使其適于色譜-質譜檢測；確證相近物種或產地來源的特征組分較為困難，需要大量真實樣本以保證所建方法的準確性。綜上，后續研究的重點將會聚焦于：①建立快速、自動化、高通量的樣品前處理方法；②結合化學計量學建立水產品真偽鑒別和溯源檢測模型，以進行非靶標模式判別；③建立動態化真實樣本數據庫和判別規則，以實現水產品真偽和產地的智能識別。