褪黑素對PDGF誘導的肝星狀細胞中JAK2/STAT3信號通路的影響

岳彩飛,洪汝濤,徐德祥，陳艷梅

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科,合肥 230022；2.安徽醫科大學毒理學系，合肥 230032)

肝纖維化已被認為是一個嚴重的公共衛生問題，是由多種病因(包括肝炎病毒、毒素、藥物、酒精和自身免疫性疾病等)引起的創傷愈合過程[1]。肝纖維化過程中，肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)首先激活并增殖，產生大量細胞外基質(extracellular matrix,ECM)[2]，因此抑制HSC的激活和增殖是預防和治療肝纖維的重要方法。HSC的激活是由大量的炎性細胞因子和生長因子介導,其中血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)是HSC中最有效的有絲分裂增殖細胞因子之一,對HSC的增殖、遷移、趨化等發揮關鍵作用[3]。PDGF與HSC質膜上的PDGFR特異性結合，從而激活JAK2/STAT3信號通路,致使HSC增殖,并抑制HSC凋亡。大量研究[4-5]已證實，褪黑素對肝纖維大鼠具有保護作用，其機制可能與其抗氧化活性及抑制相關信號通路有關。然而，褪黑素對PDGF誘導的HSC中的JAK2/Stat3通路的影響尚未被研究。本課題以PDGF誘導肝纖維化模型，探討褪黑素對HSC-T6細胞中 JAK2/ STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 DMEM購自美國Hyclone公司；HSC-T6細胞購自南京凱基生物科技發展公司；褪黑素、MTT購自美國Sigma公司；PDGF購自美國PeproTech公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、DMSO、胰酶消化液、青霉素/鏈霉素購自上海碧云天生物技術有限公司；抗JAK2抗體、抗p-JAK2抗體、抗STAT3抗體、抗p-STAT3抗體購自英國Abcam公司。

1.1.2儀器 CO2恒溫培養箱(Thermo Forma 3111，美國Thermo公司)；Tanon-5200成像系統(上海天能科技有限公司)；電泳儀(mini protean 3 cell，美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HSC-T6細胞用含10%的胎牛血清，1%青霉素/鏈霉素 的DMEM高糖培養基，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中進行培養，d 2換液，2～3 d傳代一次，收集對數期細胞進行后續實驗。

1.2.2MTT實驗 將處于對數生長期的細胞經胰蛋白酶消化，顯微鏡下計數后制成5×104個細胞/mL的細胞懸液。分別取100 μL至96孔培養板，接種3個同樣的孔作為復孔。次日按照以下分組處理細胞：對照組(PBS)、模型組(PDGF，10 μg·L-1)、褪黑素低濃度組(PDGF+1 nmol·L-1MEL),褪黑素中濃度組(PDGF+1 μmol·L-1MEL)、褪黑素高濃度組(PDGF+0.1 mmol·L-1MEL)，抑制劑組(PDGF+AG490)，每組設置3個復孔。分別于藥物作用0、24、48、72、96 h后每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，再加入180 μL無血清培養基。置于37 ℃，5% CO2培養箱孵育4 h后，吸棄孔內的上清液。每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min。用酶標儀測定490 nm波長各孔吸光度(optical density，OD)值。

1.2.3細胞免疫組化實驗 將各組制成的細胞爬片用PBS洗去培養基，再用4%甲醛固定30 min，PBS洗3 min×3次；加3% H2O2，PBS沖洗3 min×3次，1% BSA封閉1 h，PBS洗3 min×3次；滴加一抗后濕盒孵育于4 ℃冰箱孵育過夜；滴加HRP標記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20 min后，PBS沖洗3 min×3次；再用DAB染色，蘇木素復染2 min后，再經過沖洗曬干及封片，鏡下觀察，采集分析相關部位，放大200倍拍照，用Image-Pro Plus軟件分析結果。

1.2.4Western blot實驗 將處于對數生長期的細胞經胰蛋白酶消化后接種于培養瓶，細胞分組、干預同1.2.2。作用48 h后從培養箱中取出細胞，吸去培養液，適量預冷的1×PBS洗滌2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5 mL EP管中，12 000 r·min-1離心 10 min，獲得蛋白；采用BCA法進行蛋白質定量，每孔上樣量約為20 μg蛋白；然后加入到10% SDS-PAGE蛋白凝膠上樣孔內，120 V 電泳60 min，之后將蛋白質轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉(檢測磷酸化蛋白用BSA)室溫封閉1 h，根據說明書JAK2 1 ∶5 000；p-JAK2 1 ∶1 000；STAT3 1 ∶1 000；p-STAT3 1 ∶2 000；GAPDH 1 ∶10 000稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，4 ℃冰箱孵育過夜，次日孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5 min。隨后根據用量，按照1 ∶10 000稀釋HRP標記的二抗，與膜37 ℃孵育1 h，30 min后加ECL顯色液顯影。用磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白的平均灰度值比值表示蛋白表達水平。

1.3 統計學處理采用SPSS 22.0軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 褪黑素對PDGF激活的HSC-T6細胞增殖的影響利用MTT法檢測細胞增殖，與對照組比較，模型組OD值增加(F=79.13,P<0.01)；與模型組比較，褪黑素低、中、高濃度組及抑制劑組的OD值呈下降趨勢(F=79.13,P<0.01)。見Fig 1。

2.2 細胞免疫組化檢測褪黑素對PDGF誘導的HSC-T6細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達p-JAK2蛋白主要在胞質中表達，而p-STAT3蛋白主要在胞核中表達。與對照組比較，模型組中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達差異有統計學意義(tp-JAK2= 6.177,P=0.003 5；tp-STAT3=10.45,P=0.000 5);與模型組比較，褪黑素低(tp-JAK2=3.76,P=0.019 8；tp-STAT3=4.497,P=0.010 8)、中(tp-JAK2=4.85,P=0.008 3；tp-STAT3=6.858,P=0.002 4)、高實驗組(tp-JAK2=6.792,P=0.002 5；tp-STAT3=10.56,P=0.000 5)以及抑制劑組(tp-JAK2=7.922,P=0.001 4；tp-STAT3=1 087,P=0.000 4)p-JAK2、p-STAT3蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，并且隨著褪黑素濃度增加p-JAK2、p-STAT3表達的抑制作用逐漸增強。見Fig 2、3。

Fig 1 Effect of melatonin on proliferation of HSC-T6

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

2.3 Western blot檢測褪黑素對PDGF誘導的HSC-T6細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達的影響與對照組比較：模型組HSC-T6細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達增強(tp-JAK2/JAK2=8.192,P=0.001 2;tp-STAT3/STAT3= 21.53,P<0.000 1)；與模型組比較，褪黑素低(tp-JAK2/JAK2=3.28,P=0.032；tp-STAT3/STAT3=6.06,P=0.003 7)、中(tp-JAK2/JAK2=5.31,P=0.006；tp-STAT3/STAT3=7.89,P=0.001 4)、高濃度組(tp-JAK2/JAK2=11.07,P=0.000 4；tp-STAT3/STAT3=17.93,P<0.000 1)以及抑制劑組(tp-JAK2/JAK2=12.66,P=0.000 2；tp-STAT3/STAT3=22.39,P<0.000 1)HSC-T6細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平降低，并隨著褪黑素濃度升高蛋白表達量逐漸下降。見Fig 4。

Fig 2 Effect of melatonin on p-JAK2 protein expression by

A: Control group;B: Model group;C: MEL 1 nmol·L-1;D: MEL 1 μmol·L-1;E:MEL 0.1 mmol·L-1;F:Inhibitor group;**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Fig 3 Effect of melatonin on p-STAT3 protein expression by

A:Control group;B:Model group;C:MEL 1 nmol·L-1;D:MEL 1 μmol·L-1;E:MEL 0.1 mmol·L-1;F:Inhibitor group;**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Fig 4 Effect of melatonin on expression of p-JAK2 and p-STAT3 proteins by Western

A:Control group;B:Model group;C:MEL 1 nmol·L-1;D:MEL 1 μmol·L-1;E:MEL 0.1 mmol·L-1;F:Inhibitor group;**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病的病理組成部分，HSC是肝臟中主要的膠原生成細胞，其活化促進肝纖維化[6]。因此，如果能夠抑制HSC的活化和增殖，理論上可以減少甚至逆轉肝纖維化的發生和發展。PDGF-BB是目前已知的最強的促進HSC活化的細胞因子之一,位于HSC質膜上的PDGFR是PDGF跨膜傳遞的關鍵環節[7]。JAK2/STAT3信號通路是一條多種細胞因子共用的信號傳導途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等過程[8-9]。該信號通路被激活后，使得STAT3 發生磷酸化并形成二聚體，轉移到細胞核后，與 DNA 上的特定序列結合，誘導相應基因的表達,使HSC活化增殖，最終導致肝纖維化。AG490 能夠特異性抑制JAK2 的酪氨酸磷酸化，從而阻斷STAT3的磷酸化，最終抑制HSC的活化增殖[10]。

褪黑素又稱松果體素,是一種生命必需的吲哚胺類物質，人體中褪黑素具有增強免疫力、延緩衰老、調節晝夜節律等作用，近年來研究[4，11]顯示，其對肝損傷模型有較強的保護作用，但是其具體機制尚不明確。而褪黑素對PDGF誘導的肝星狀細胞JAK2/STAT3信號通路的影響國內外尚未見報道。

本課題組前期實驗[5]已經證實，褪黑素濃度增加至1 mmol·L-1，HSC增殖顯著被抑制，以及參照Shajari等[12]的褪黑素通過視黃酸相關孤兒核受體介導5-脂氧合酶抑制HSC增殖實驗中的褪黑素濃度,因此采用1 nmol·L-1、1 μmol·L-1和0.1 mmol·L-1作為實驗組褪黑素的藥物濃度，該實驗研究結果顯示采用PDGF濃度為10 μg·L-1可激活HSC-T6細胞，與Wang等[13]用該濃度PDGF激活HSC相一致。MTT實驗證明褪黑素可明顯抑制PDGF激活的HSC-T6細胞的增殖；免疫組化實驗和Western blot實驗結果顯示PDGF能顯著激活HSC-T6細胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達，而褪黑素實驗組及抑制劑組HSC-T6細胞中的p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達量呈下降趨勢，且隨褪黑素濃度的升高下降水平越明顯，提示肝纖維化過程中JAK2/STAT3信號通路被激活，并且褪黑素能夠抑制該通路。

綜上所述，褪黑素可抑制PDGF誘導的HSC的活化與增殖，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關，這可能是褪黑素改善肝纖維化的機制之一；此項研究為抑制肝纖維化提供新的治療靶點。

(感謝安徽醫科大學公共學院毒理學實驗室徐德祥院長、王取南老師、王華老師、付林師兄等在實驗中給予我的無私支持和幫助。感謝安徽醫科大學第一附屬醫院中心試驗室所有老師在免疫組化上給予我的支持和幫助。感謝安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科楊仁俊、范圓圓、劉浩波、陳艷梅等在細胞培養上給予我的支持和幫助。)