甘棗寧治療非酒精性脂肪性肝病的網絡藥理學機制

余欽， 趙沙沙， 王婉先， 姚曼， 鄭國銀， 翟笑楓， 凌昌全，3

（1.上海中醫藥大學研究生院，上海 201203；2.海軍軍醫大學附屬長海醫院中醫腫瘤科，上海 200433；3.海軍軍醫大學中醫系，上海 200433）

甘棗寧系海軍軍醫大學第一附屬醫院院內制劑，由大棗、山藥、佛手、山楂、荷葉、玉米須組成，諸藥合用可起到疏肝健脾、理氣和胃、利濕化濁的功效。甘棗寧可明顯減輕肝組織內脂肪變性，降低血清總膽固醇與天冬氨酸轉氨酶水平，對高脂飲食誘發的大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）具有一定的預防作用[1]。臨床研究表明，甘棗寧對非酒精性脂肪肝（NAFL）[2]、非酒精性脂肪肝炎（NASH）[3]都具有良好的療效。但是由于中藥多靶點的特點[4-6]，甘棗寧主要活性成分和作用機制仍不明確，故本研究應用網絡藥理學方法，分析、預測甘棗寧各成分靶點及藥物機理，以為今后的實驗研究指明方向，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1甘棗寧的活性成分及靶點挖掘利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）[7]（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及中藥系統藥理學成分分析平臺（BATMAN-TCM）（http：//bionet. ncpsb.org/batman-tcm/），獲取甘棗寧6 味中藥的化學成分，篩選出符合條件的候選化合物對應靶點[口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件]。

1. 2 NAFLD相關靶點獲取以“nonalcoholic simple fatty liver”OR “nonalcoholic fatty liver”OR“fatty liver”OR“fatty liver hepatitis”OR“AFL”OR“NAFLD”OR“nonalcoholic fatty liver disease”OR“hepatic steatosis”為檢索詞，在GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org）、Drugbank 數據庫（https：//www. drugbank.ca/releases/latest）、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫、比較毒理基因組學數據庫（CTD）、治療靶點數據庫（TTD）中搜索NAFLD的相關靶點。

1.3“中藥化學成分—作用靶點”網絡的構建將中藥的預測靶點映射至NAFLD 相關靶點，所得交集靶點即為甘棗寧作用于NAFLD的預測靶點。構建中藥化學成分—作用靶點網絡，利用Cytoscape 3.7.1軟件[8]進行可視化作圖。

1.4基因本體論（GO）、蛋白質相互作用（PPI）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用Metascape 數據庫[9]，導入交集基因，選擇物種為“Homo Sapiens”，獲得靶基因官方名稱（official gene symbol），進行GO分析、PPI和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1候選化合物及靶點的篩選結果

2.1.1 中藥—化合物網絡構建 通過檢索TCMSP和BATMAN-TCM數據庫獲得甘棗寧有效活性成分84 個，其中山楂28 個、玉米須8 個、佛手4 個、山藥12個、大棗18個和荷葉14個。根據化合物富集基因數量，借助軟件Cytocsape 3.7.1 構建中藥—化合物相互作用網絡，網絡中有90個節點和78條邊。圖中度值最高的化合物為槲皮素（quercetin），其次為豆甾醇（stigmasterol），荷葉堿（nuciferin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）等也有較高度值，見圖1、表1。推測這些度值較高的化合物可能是甘棗寧發揮治療NAFLD的關鍵活性成分。

圖1 甘棗寧中藥—化合物網絡圖Figure 1 Chinese herbal medicine-compound network diagram

表1 甘棗寧主要化合物基本信息Table 1 Basic information of key compounds in Ganzaoning

2.1.2 甘棗寧化合物—靶基因網絡構建 在甘棗寧84 個化學成分中，對應靶點基因353 個，見圖2。圖中淺綠、深綠、黃色、橙色、紫色、粉色圓圈分別代表大棗、山楂、佛手、山藥、玉米須、荷葉；中間三角形為化合物對應的靶基因。

2.2 NAFLD與甘棗寧交集靶點獲取及可視化網絡構建根據檢索條件，獲得NAFLD 對應靶點921個。將353個甘棗寧化合物靶點與921個NAFLD靶點取交集，得到73個交集基因，見圖3。圖3最外面的圓圈中，紅色、藍色分別代表甘棗寧與NAFLD 對應的基因。內圈淡橙色為唯一基因，深橙色為甘棗寧與NAFLD 共有基因。紫色曲線連接相同的基因，藍色曲線連接的基因屬于同一富集的集群。

2.3甘棗寧治療NAFLD生物學過程和通路富集分析甘棗寧73個基因標識符首先使用Metascape數據庫的最新版本（最后一次更新是在2019 年8 月14 日）轉換為相應的H.sapiens Entrez 基因標識符。對于73 個基因列表，都通過以下本體源進行了通路和過程富集分析：GO 生物過程、KEGG 通路、反應體基因集、典型通路和CORUM。基因組中的所有基因都被用作富集背景。收集P值＜0.01 的項，最小計數為3，富集因子＞1.5（富集因子是觀測到的計數與隨機期望計數之比），根據其隸屬度相似性將其分組。更具體地說，P值是基于累積超幾何分布計算的，q值是使用Banjamini-Hochberg程序計算的，用于解釋多次測試。在對豐富項進行層次聚類時，使用Kappa scores 4 作為相似性度量，將相似性＞0.3 的子樹視為一個聚類。選擇集群中統計上最重要的術語來表示集群，富集最明顯的前20個集群（通路和生物學過程），見圖4。

2.3.1 術語網絡 為了進一步捕獲術語之間的關系，我們選擇了一組豐富的術語，并將其呈現為網絡圖，其中具有相似度＞0.3 的術語由邊緣連接。我們從每20 個集群中分別選擇具有最佳P值的術語，條件是每個集群不超過15 個術語，總共不超過250 個術語。使用Cytoscape 可視化網絡，其中每個節點表示一個豐富的術語，并首先根據其集群ID（見圖5-a）和P值（見圖5-b）著色。

圖2 甘棗寧中藥化合物—靶點網路圖Figure 2 Ganzaoning Chinese herbal medicine compound-target network diagram

圖3 甘棗寧與NAFLD基因交叉圖Figure 3 Overlaps between gene lists of Ganzaoning and NAFLD

2. 3. 2 KEGG 富集通路分析結果 KEGG 通路富集分析發現73 個交集靶點顯著富集的通路，信息見表2。富集最明顯的10條通路包含糖尿病并發癥相關的晚期糖基化終末化產物（AGE）及晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、白細胞介素-4（IL-4）—白細胞介素-13（IL-13）信號通路、癌癥通路、NAFLD 信號通路和胰島素抵抗（IR）通路等，提示甘棗寧通過作用于以上多條通路來發揮治療NAFLD的作用。

2.3.3 GO 功能分析結果 73 個甘棗寧—NAFLD交集基因影響多個生物學過程，包括應對營養物質水平、應對脂多糖，細胞應對有機氮化合物、應對無機物、活性氧代謝等生物過程。具體見表3。

圖4 甘棗寧73個交叉基因富集柱狀圖Figure 4 Ganzaoning Bar graph of enriched terms of 73 overlapped genes

圖5 富集集群網絡圖Figure 5 Network of enriched terms

表2 KEGG通路富集分析（前10位）Table 2 KEGG pathway enrichment analysis（top 10）

2.4交集基因的PPI分析對于73個交集基因的基因列表，利用BioGrid6[10]、InWeb_IM7、OmniPath8[11]數據庫進行PPI富集分析。生成的網絡包含與列表中至少一個其他成員形成物理交互的蛋白質子集。分子復雜檢測（MCODE）算法[12]已被用于識別密集連接的網絡組件。已經收集了為單個基因列表識別的MCODE網絡，如圖6所示。PPI互作P值最顯著的3 個生物學過程：糖尿病并發癥AGERAGE信號通路、IL-4-IL-13信號通路、液體剪切應力和動脈粥樣硬化通路。將pathway 和process enrichment analysis 分別應用于每個MCODE 組件，并保留了3個P值得分最高的術語作為對應組件的功能描述，見表4。甘棗寧治療NAFLD 的核心基因及所屬MCODE子集信息見表5。

表3 GO生物學過程富集分析（前10位）Table 3 GO Biological Processes（top 10）

圖6 PPI網絡及MCODE模塊分析Figure 6 PPI network and MCODE analysis

3 討論

本研究利用網絡藥理學方法，通過相應數據庫和軟件的挖掘，建立了甘棗寧治療網絡，同時對相應靶點進行了通路富集分析。篩選出了甘棗

寧治療NAFLD 的關鍵化合物、核心基因，富集的生物學過程及通路。

3.1核心化合物與NAFLD 槲皮素可通過多種通路途徑達到治療NAFLD 的作用[13-14]。槲皮素對果糖和膽固醇飲食誘導的肝脂積累具有預防作用[15]，可通過調節脂肪酸相關代謝物、炎癥相關代謝物等差異代謝物[16]，通過降低三酰甘油的積累、胰島素抵抗、炎癥細胞因子的分泌等有效逆轉NAFLD癥狀[17]。槲皮素能降低血清轉氨酶水平，并能顯著降低2 型糖尿病（T2DM）誘導的肝臟組織學改變，可能是治療T2DM 誘導的NAFLD 的潛在有效藥物[18]。植物甾醇（豆甾醇、β-谷甾醇）顯示出對NAFLD 的保護作用，豆甾醇比β-谷甾醇更有效，這可能是因為它可以抑制肝脂肪生成基因的表達和調節循環神經酰胺水平[19-20]。木犀草素通過肝臟和脂肪組織之間的相互作用，改善飲食引起的肥胖及其共病的有害影響[21]，在體內和體外均可減少脂質積累，并可能成為治療NAFLD 的潛在治療藥物[22]。本研究結果與以上報道相符，說明甘棗寧治療NAFLD 具有多成分共同作用的特點。

3.2關鍵信號通路與NAFLD 糖尿病并發癥相關AGE-RAGE信號通路：AGEs 主要是在衰老和一定的病理條件下，由蛋白質、脂類和核酸在非酶糖基化和氧化過程中產生的一組復雜化合物。AGERAGE 軸與NAFLD 的發病機制密切相關[23]，肝臟AGE 水平的升高和微循環紊亂可能在肝損傷的發病機制中起一定作用，是NAFLD 的重要組成部分。針對AGE-RAGE 信號通路的藥物和飲食策略可以減緩NAFLD的進展[24]。

表4 甘棗寧治療NAFLD的生物學過程和通路富集分析Table 4 Biological processes and pathway enrichment information involving key targets of Ganzaoning treatment for NAFLD

表5 甘棗寧治療NAFLD的關鍵基因列表Table 5 List of key genes of Ganzaoning treatment for NAFLD

NAFLD 信號通路：該通路包含IR 信號通路、腺苷酸依賴的蛋白激酶（AMPK）信號通路等。 IR與NAFLD的發病密切相關，NAFLD患者的IR可能增加疾病進展的風險[25]。肝臟特異性AMPK的激活可以重組脂質代謝，減少肝臟脂肪變性，減少炎癥和纖維化基因的表達，在飲食導致的肥胖中具有顯著的治療效果，AMPK 可作為預防和治療NAFLD 的目標[26]。甘棗寧的活性成分槲皮素能通過AMPK途徑發揮治療NAFLD 的作用，能改善IR狀態[27-28]。山柰酚苷通過增強脂聯素誘導的信號轉導和AMPK 在肝臟的激活，有效地降低高血糖和肝脂肪變性[29]。荷葉廣泛用于調節肥胖，其有效成分原荷葉堿和荷葉堿能改善IR型3T3-L1脂肪細胞的糖脂代謝，這可能與AMPK 信號通路的激活有關[30]。

IL-17 信號通路：Th17 細胞和Th17 相關的細胞因子在各種肝病中被激活，IL-17在肝臟疾病中的重要作用已被認識多年[31]。肥胖驅動的IL-17軸激活是NAFLD 向脂肪性肝炎發展和進展的核心，并確定IL-17 通路是該疾病的一個新的治療靶點[32]。人肝炎、脂肪肝和病毒性肝炎相關肝細胞癌（HCC）的IL-17A 水平升高與脂肪變性呈正相關。IL-17A 阻滯劑可預防高危患者的IR、NASH 和HCC[33]。

3.3甘棗寧治療NAFLD涉及的核心靶點及生物學過程PPI 分析發現JUN、RELA、HSP90AA1、APP、AKT1、TP53等可能是甘棗寧治療NAFLD的核心靶點。甘棗寧治療NAFLD 核心基因涉及的生物學過程，富集最多的為對營養、脂多糖的反應調節，對有機氮化合物的反應。甘棗寧參與因營養物質的出現、缺乏或聚集而引起的細胞或有機體狀態或活動變化的過程中，參與脂多糖刺激而導致有機體的狀態或活動發生變化的過程中，從而發揮治療NAFLD的作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的方法和技術，闡述了甘棗寧治療NAFLD 的活性成分、作用靶點和作用通路之間的關系，發現甘棗寧多成分、多靶點、多通路的特點，提示甘棗寧可能通過6味中藥中的核心化合物，參與上述生物學過程及相關通路，來達到治療NAFLD的效果。

本研究為進一步的實驗研究和臨床應用提供了思路和參考依據，也為中藥復方作用機制提供了新方向。但是，本研究依舊存在一些不足需要解決，如網絡藥理學是基于數據進行研究，數據搜集的全面與否及活性成分篩選標準的制定尚不能做到完全準確，此外，本研究尚未考慮藥物劑量及煎服方法對治療結果的影響，因此本課題組將在今后進一步通過動物實驗去驗證本研究結果。