艾迪注射液對兔舌VX-2鱗癌模型化療外周血中Th1/Th2平衡的影響

王明雪， 殷杰， 張霓霓， 易杰， 黃桂林

（遵義醫科大學附屬口腔醫院，貴州遵義 563000）

世界范圍內頭頸部鱗狀細胞癌（以下簡稱鱗癌）每年約有50萬新發病例，口腔鱗癌是頭頸部區域最常見的腫瘤，占口腔腫瘤的90%，而其中舌部鱗癌新發病例為16萬[1]。由于口腔癌發生部位的特殊性，因此治療此類癌癥要注意2個要素，即完整切除腫瘤和對功能的保護。口腔癌一般采用綜合性的治療，除了外科手術治療，還采用放療、化療、免疫治療等。艾迪注射液以斑蝥、人參、黃芪、刺五加為主要成分，已經是一種臨床上較為常用的治療腫瘤性疾病的中藥制劑，具有扶正祛邪、免疫調節以及抗腫瘤的作用[2-4]。本研究擬進一步觀察艾迪注射液單獨使用或聯合化療藥物對兔舌VX-2鱗癌腫瘤模型外周血中免疫因子的影響，從而為臨床輔助治療舌鱗癌提供理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物兔VX-2 腫瘤細胞株購于中山大學實驗動物中心細胞庫。新西蘭大白兔84 只，2～3 月齡，體質量1.5～2.0 kg，雌雄不限，購于中山大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2014-0023。均飼養于遵義醫學院實驗動物中心，飼養環境：兔舍溫度為（20 ± 3）℃，相對濕度為（50 ±10）%，適量光照，青綠色顆粒飼料、清潔飲用水。新西蘭大白兔在上述環境條件下適應性喂養1 周，再進行建模及給藥。本實驗所有對實驗動物的操作均通過遵義醫學院動物實驗倫理委員會倫理審查同意后實施。

1.2藥物艾迪注射液，10 mL/支，貴州益佰制藥股份有限公司，國藥準字Z52020236；紫杉醇注射液（Paclitaxel Injection），30 mg/支，哈藥集團有限公司，國藥準字H20059962。

1.3試劑與儀器兔干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、兔腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒購于北京誠林生物科技有限公司；兔白細胞介素（IL）-2 ELISA 試劑盒、兔IL-6 ELISA試劑盒、兔IL-10 ELISA試劑盒購于康寶生物公司。酶標儀（美國Thermo公司）。

1.4兔舌VX-2鱗癌模型的建立對60 只新西蘭大白兔行瘤粒植入術，30 mg/kg戊巴比妥鈉經兔耳緣靜脈注射，約10 min 后麻醉生效，兔結膜反射消失。將兔子固定在手術臺上，用繃帶牽拉兔子的上下前牙，使兔子呈大開口狀態，完全暴露口腔。在無菌條件下，用無齒鑷將兔舌牽拉出口外傾向一側，在兔右側舌緣的前中1/3交界處，沿舌體長軸方向做長3～4 mm 的切口，深約5 mm，切開黏膜及舌肌，用眼科鑷將瘤粒4～5 枚放入切口內，植入舌肌中。嚴密縫合切口（從腫瘤組織切取出到植入瘤粒完成，時間控制在2 h 內）。實驗兔術后連續3 d給予青霉素鈉（3萬U·kg-1·d-1）肌肉注射，預防創口感染。各兔單獨籠養，正常清潔飼養。

1.5分組與給藥在建模成功的56 只荷瘤兔中，選取舌部腫瘤直徑為1.0 cm 左右的荷瘤兔48 只，隨機分成4 組，每組12 只。再選擇24 只健康兔，隨機分成2 組，每組12 只。綜上，本實驗共分6組：A、B、C、D、E、F 組（A、B 組為健康兔；C、D、E、F 組為荷瘤兔）。采用經兔耳緣靜脈注射的給藥方式。具體分組及用藥方式：A 組（健康兔+ 生理鹽水），經兔耳緣靜脈推注生理鹽水20 mL，連續2 周；B 組（健康兔+ 艾迪注射液），經兔耳緣靜脈推注艾迪注射液（生理鹽水稀釋到20 mL），連續2周；C組（荷瘤兔+生理鹽水），經兔耳緣靜脈推注生理鹽水20 mL，連續2 周；D 組（荷瘤兔+紫杉醇注射液），給藥第1天給予荷瘤兔紫杉醇注射液（將紫杉醇注射液用生理鹽水稀釋到20 mL 后，用微量注射泵經兔耳緣靜脈輸液給藥，6.67 mL/h），第1周剩余6 d及第2周均經兔耳緣靜脈推注生理鹽水20 mL；E 組（荷瘤兔+ 艾迪注射液），經兔耳緣靜脈推注艾迪注射液（生理鹽水稀釋到20 mL），連續2周；F組（荷瘤兔+紫杉醇注射液+艾迪注射液），給藥第1 天給予紫杉醇注射液（將紫杉醇注射液用生理鹽水稀釋到20 mL 后，用微量注射泵經兔耳緣靜脈輸液給藥，6.67 mL/h），第1 周剩余6 d 及第2 周均經兔耳緣靜脈推注艾迪注射液（將生理鹽水稀釋到20 mL）。

1.6藥物劑量的折算及實驗兔給藥劑量本實驗設定人的體質量為60 kg，實驗兔的體質量為1.5 ～2.0 kg，平均體質量為1.8 kg，實驗兔體表面積的計 算 公 式[5]：A=K×。A：兔體表面積（cm2）；K= 10.1，為常數；W：兔體質量（g）。即體質量1.8 kg 兔的體表面積為0.149 5 m2。中國人體表面積的計算用Stevenson 公式[6]：A1=0.006 1×H+ 0.012 8 ×W1- 0.152 9。A1：體表面積（cm2）；H：身高（cm）；W1：體質量（kg）。即人的體表面積為1.621 6 m2。實驗兔給藥劑量的折算公式[5，7]：D＝D1×A/W。D：實驗兔的給藥劑量（mg/kg）；D1：人的給藥劑量（mg/kg）。根據人化療藥物的使用劑量折算實驗兔藥物的使用劑量（詳見表1）。課題小組前期的實驗[8]發現，經過動脈灌注化療給予荷瘤兔全劑量的紫杉醇注射液時，荷瘤兔的死亡率相對較高，因此，為了避免實驗過程中的動物死亡，使荷瘤兔能夠耐受紫杉醇注射液的化療，本次實驗給予紫杉醇注射液的安全劑量是荷瘤兔最大劑量的一半，即將紫杉醇注射液用生理鹽水稀釋到20 mL，用微量注射泵經荷瘤兔耳緣靜脈給藥，速度為6.67 mL/h。艾迪注射液人的用法為每次50～100 mL，每日1次，用生理鹽水稀釋到500 mL后靜脈滴注。擬定人的體質量為60 kg，換算為人給藥量為0.83～1.66 mL/kg，折算后實驗兔的給藥量為2.55～5.10 mL/kg。本實驗是按照艾迪注射液最大劑量5.10 mL/kg 給藥，用生理鹽水稀釋到20 mL 后經兔耳緣靜脈推注，每日1 次。紫杉醇注射液使用前30 min 用地塞米松磷酸鈉注射液肌肉注射，預防紫杉醇注射液過敏。

表1 藥物使用劑量表Table 1 Dosage given comparison

1. 7 ELISA檢測分別在給藥前1 d，給藥第7、14 天，采用ELISA 法檢測實驗兔外周血中IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α 水平的變化。具體步驟按照試劑盒說明書。

1.8脾臟指數在給藥第7、14 天，各組分別處死6只實驗兔，先稱量實驗兔的體質量，并按標號記錄。將實驗兔麻醉后，對兔子進行解剖。先給實驗兔腹部備皮，予以碘伏消毒鋪巾，在實驗兔腹部行縱向切口，打開腹腔，解剖分離，取出其脾臟，做好標記，統一置于冰盒中。待送回實驗室后，脾臟置于濾紙上1 h，再稱量脾臟的質量（m/mg）、兔子的體質量（m/g），計算脾臟指數（splenic index，SI）。公式：脾臟指數=脾臟質量/體質量×10。

1. 9統計方法采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析，實驗數據均以均數± 標準差（±s）表示，多組比較采用單因素ANOVA檢驗。當方差齊時各組間數據的兩兩比較采用Tukey檢驗，當方差不齊時各組間數據的兩兩比較采用Dunnett’s T3檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1兔舌VX-2鱗癌模型建立情況建模成功后，可見模型兔右側舌緣隆起，表面黏膜較完整，未見明顯破潰，呈浸潤性生長，捫及包塊質韌，活動度較差，與周圍組織邊界不清，與舌肌輕度粘連，見圖1-A。鏡下可見舌部瘤體組織形態結構混亂，見有絲分裂象，未見病理性核分裂象，細胞異型性明顯，未見角化，如圖1-B所示。

2.2各組荷瘤兔舌部瘤體變化隨著給藥時間的增加，F 組舌部瘤體明顯縮小，破潰皮損部分愈合，荷瘤兔的精神及飲食狀態較好；E組荷瘤兔的狀態較D 組荷瘤兔好，但舌瘤體的大小改變不明顯；D組舌瘤體縮小，破潰明顯，荷瘤兔的精神及飲食較差；C組荷瘤兔精神及飲食較差，舌瘤體組織不僅無明顯縮小，且有增大趨勢，破潰糜爛明顯。

圖1 兔舌VX-2鱗癌模型建立情況Figure 1 Establishment of rabbit tongue squamous VX-2 cell carcinoma

2.3各組兔外周血中TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10的水平表2 ～6 結果顯示：給藥前1 d 各組荷瘤兔之間及健康兔與荷瘤兔之間TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10 水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。表明給藥前各組之間的免疫因子水平無明顯差異。

治療第7、14 天，作為對照的A、B、C 組間TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10 水平比較，差異亦均無統計學意義（P＞0.05）。表明VX-2 腫瘤細胞移植在實驗成瘤的28 d 內尚不足以使兔體內免疫因子水平發生改變。

表2 各組兔外周血TNF-α水平比較Table 2 Comparison of TNF-α level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

表2 各組兔外周血TNF-α水平比較Table 2 Comparison of TNF-α level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

①P ＜0.05，與C 組比較；②P ＜0.05，與D 組比較；③P ＜0.05，與E組比較

組別A組（健康兔+生理鹽水）B組（健康兔+艾迪）C組（荷瘤兔+生理鹽水）D組（荷瘤兔+紫杉醇）E組（荷瘤兔+艾迪）F組（荷瘤兔+聯合用藥）給藥前1 d（N=12只）90.22±18.84 82.93±20.02 77.97±28.39 77.75±16.12 71.87±21.74 77.73±16.87給藥第7天（n=6只）75.63±17.12 89.01±13.69 64.63±11.19 77.57±7.22 115.73±35.40①134.21±31.77①②給藥第14天（n=6只）75.40±14.99 97.70±11.56 75.19±21.14 76.06±6.12 197.73±40.81①②306.36±27.20①②③

2. 3. 1 Th1 型免疫因子 治療第7 天，E、F 組TNF-α 水平高于C 組（P＜0.05），且F 組TNF-α 水平明顯高于D組（P＜0.05）。治療第14天，E、F組TNF-α 水平均高于C、D 組（P＜0.05），且F 組TNF-α 水平顯著高于E 組（P＜0.05）。而D 組治療第7、14天TNF-α水平與C組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組外周血IFN-γ水平比較Table 3 Comparison of IFN-γ level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

表3 各組外周血IFN-γ水平比較Table 3 Comparison of IFN-γ level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

①P ＜0.05，與C 組比較；②P ＜0.05，與D 組比較；③P ＜0.05，與E組比較

組別/時間A組（健康兔+生理鹽水）B組（健康兔+艾迪）C組（荷瘤兔+生理鹽水）D組（荷瘤兔+紫杉醇）E組（荷瘤兔+艾迪）F組（荷瘤兔+聯合用藥）給藥前1天（N=12只）85.93±12.71 87.54±15.15 73.80±28.91 66.25±10.84 66.52±17.17 70.09±12.61給藥第7天（n=6只）85.34±13.05 105.96±16.07 61.59±15.93 66.33±9.15 89.58±17.00①154.29±29.38①②給藥第14天（n=6只）83.11±5.65 101.20±8.87 73.54±32.60 65.01±6.34 166.48±24.84①②277.86±31.78①②③

表4 各組外周血IL-2水平比較Table 4 Comparison of IL-2 level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

表4 各組外周血IL-2水平比較Table 4 Comparison of IL-2 level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

①P ＜0.05，與C 組比較；②P ＜0.05，與D 組比較；③P ＜0.05，與E組比較

組別/時間A組（健康兔+生理鹽水）B組（健康兔+艾迪）C組（荷瘤兔+生理鹽水）D組（荷瘤兔+紫杉醇）E組（荷瘤兔+艾迪）F組（荷瘤兔+聯合用藥）給藥前1天（N=12只）10.39±2.74 10.62±2.92 12.52±4.07 8.33±2.07 8.06±3.90 11.19±3.82給藥第7天（n=6只）10.35±2.04 13.37±3.53 10.11±3.82 8.74±2.17 15.30±3.16②20.47±4.89①②給藥第14天（n=6只）9.48±1.25 14.53±4.30 8.14±2.43 8.99±2.69 17.90±3.93①33.18±4.56①②③

表5 各組外周血IL-6水平比較Table 5 Comparison of IL-6 level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

表5 各組外周血IL-6水平比較Table 5 Comparison of IL-6 level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

①P ＜0.05，與C組比較；②P ＜0.05，與D組比較

組別/時間A組（健康兔+生理鹽水）B組（健康兔+艾迪）C組（荷瘤兔+生理鹽水）D組（荷瘤兔+紫杉醇）E組（荷瘤兔+艾迪）F組（荷瘤兔+聯合用藥）給藥前1天（N=12只）9.14±1.70 10.07±1.92 8.29±2.03 10.02±1.93 9.95±2.10 10.52±2.34給藥第7天（n=6只）8.50±1.75 7.58±2.26 8.22±2.50 7.75±2.37 3.29±1.68①②2.90±2.09①②給藥第14天（n=6只）8.82±1.60 8.67±2.29 10.19±2.50 8.08±1.76 2.01±0.59①1.34±1.05①②

表6 各組外周血IL-10水平Table 6 Comparison of IL-10 level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

表6 各組外周血IL-10水平Table 6 Comparison of IL-10 level in peripheral blood of various groups [±s，ρ/（ng·L-1）]

①P ＜0.05，與C組比較；②P ＜0.05，與D組比較

組別/時間A組（健康兔+生理鹽水）B組（健康兔+艾迪）C組（荷瘤兔+生理鹽水）D組（荷瘤兔+紫杉醇）E組（荷瘤兔+艾迪）F組（荷瘤兔+聯合用藥）給藥前1 d（N=12只）12.03±3.07 12.26±3.48 11.81±5.48 13.27±2.70 12.25±3.69 13.74±2.73給藥第7天（n=6只）12.46±2.78 12.88±2.58 13.21±5.69 8.35±1.34 4.77±3.38①3.31±1.01①②給藥第14天（n=6只）11.34±2.93 12.35±4.13 18.50±4.17 9.77±1.80 1.90±0.91①②1.48±0.94①②

治療第7、14天，各組間IFN-γ水平比較結果同TNF-α。

而在IL-2水平上，治療第7天，F組IL-2水平高于C 組（P＜0.05），E、F 組IL-2 水平高于D 組（P＜0.05）；治療第14天，E、F組IL-2水平高于C組，且F 組IL-2 水平顯著高于D、E 組（P＜0.05）。而D組治療第7、14天IL-2水平與C組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

結果表明，在荷瘤兔治療方式對比中，使用艾迪注射液后Th1型免疫因子整體呈上升趨勢，且艾迪注射液聯合化療后其上升趨勢更加明顯。

2.3.2 Th2型免疫因子 治療第7天，E、F組IL-6水平低于C、D組（P＜0.05）。治療第14天，E、F組IL-6 水平低于C 組（P＜0.05），F 組IL-6 水平低于D組（P＜0.05）。且治療第7、14 天，E 組、F 組IL-6 水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。而D組治療第7、14天IL-6水平與C組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

治療第7天，E、F組IL-10水平低于C組（P＜0.05），F組IL-10水平低于D組（P＜0.05）。治療第14 天， E、F 組IL-10 水平均低于C、D 組（P＜0.05）。且治療第7、14 天，E 組、F 組IL-10 水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。而D 組治療第7、14 天IL-10 水平與C 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

結果表明，艾迪注射液單獨或與化療藥物聯合使用可下調舌鱗癌兔Th2 型免疫因子IL-6、IL-10。

2. 4各組脾臟指數比較給藥第7、14 天，C 組脾臟指數與A、B 組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），E、F 組脾臟指數均高于C、D 組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且E、F組脾臟指數之間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表7。表明艾迪注射液單獨或與化療藥物的聯合使用可提高舌鱗癌兔的免疫功能，優于單純紫杉醇化療。

表7 各組脾臟指數比較Table 7 Comparison of spleen index of various groups （±s）

表7 各組脾臟指數比較Table 7 Comparison of spleen index of various groups （±s）

①P ＜0.05，與C組比較；②P ＜0.05，與D組比較

組別A組（健康兔+生理鹽水）B組（健康兔+艾迪）C組（荷瘤兔+生理鹽水）D組（荷瘤兔+紫杉醇）E組（荷瘤兔+艾迪）F組（荷瘤兔+聯合用藥）n/只6 6 6 6 6 6給藥第7天0.052±0.003 0.055±0.002 0.050±0.002 0.054±0.002 0.067±0.002①②0.078±0.002①②給藥第14天0.052±0.003 0.056±0.002 0.049±0.002 0.050±0.002 0.067±0.002①②0.080±0.003①②

3 討論

目前，舌鱗癌主要的治療方法是以手術治療為主，同時輔以放療和化療，再聯合中醫藥物的治療、免疫療法以及生物治療等[9]。放療、化療是治療舌鱗癌首選的輔助治療方式之一，但隨著放療、化療次數的增加，患者可能出現免疫功能下降的情況，如消化不良、骨髓抑制等不良反應等。因此，尋找化療期間可提升免疫功能的中醫藥制劑正是目前舌鱗癌治療需進一步探討及研究的項目。

艾迪注射液是臨床中常用的治療各種惡性腫瘤中藥靜脈制劑，可以抑制和殺傷腫瘤細胞。其抑制和殺傷的機制主要為：（1）注射液中的斑蝥素可以阻滯腫瘤細胞的有絲分裂或使有絲分裂紡錘體發生異常；（2）人參皂苷通過激活蛋白激酶抑制劑，影響腫瘤細胞G1 期的時程，誘導細胞凋亡，抑制mRNA 的表達，使腫瘤細胞的增殖受到限制，從而達到抑制腫瘤細胞的生長。艾迪注射液因能改善腫瘤患者在放化療過程中的不良反應，提高腫瘤患者的生存質量，故可作為癌癥患者化療的輔助用藥。在臨床上廣泛應用于原發性肝癌[10-11]、肺癌[12-14]、婦科腫瘤[15]、消化道惡性腫瘤[16]等多種惡性腫瘤的治療，其不僅能增強機體的特異性免疫功能，還可提高非特異性免疫功能和應激能力[17]。

近年來，Th1/Th2細胞亞群的狀態是腫瘤免疫治療研究中的一個熱點[18]。伴隨腫瘤免疫治療的不斷發展，因天然產物的藥物毒副作用較小，同時還對免疫功能具有一定的調節作用等優點，也在腫瘤的免疫研究中備受青睞[19]。大量的研究發現，艾迪注射液能夠調節腫瘤的免疫機制，對Th1/Th2型細胞因子產生影響。早在1986 年，Mosmann 等根據小鼠分泌細胞因子的不同將Th 細胞分為2 個功能亞型（Th1、Th2）[20]。隨后，在人類和其他物種中發現了Th1和Th2亞型。機體在正常的生理條件，Th1/Th2是處在一個相對平衡的狀態下，而在這個動態的平衡中，機體是通過調節Th1/Th2細胞的比例來調節體液免疫或細胞免疫[21-22]。但是當機體功能處于異常狀態的時候，細胞因子平衡的網絡就會遭到破壞，一般會伴隨著Th1/Th2平衡的失調，這種現象被稱為“Th1/Th2 平衡漂移”，此狀態會對機體的免疫調節功能造成紊亂，致使機體趨向病態[19]。Th1 細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α 等，介導細胞免疫反應和遲發型過敏反應，主要在針對外源性病原體以及腫瘤的免疫防御中發揮作用。Th2 細胞分泌IL-6、IL-10 等，刺激細胞增殖和抗體產生，介導體液免疫，此類細胞因子可能介導機體的免疫抑制和腫瘤免疫逃逸[23-24]。

脾臟是機體重要的免疫器官之一，它既是外周免疫器官，也是機體免疫的第三道防線，具有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，但B淋巴細胞比例較大，因此與體液免疫關系更為密切。脾臟指數的高低決定了其中淋巴細胞增殖的程度，可以在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。通常免疫器官質量的增加表示免疫能力的增強，免疫器官指數越大表明動物的免疫能力越強[25]。

本實驗結果表明，單純艾迪注射液可能促進Th1型細胞因子的分泌，抑制Th2型細胞因子的分泌，使Th1/Th2 平衡向Th1 占優勢的狀態漂移，且艾迪注射液聯合紫杉醇注射液較單純艾迪注射液對Th1型細胞因子的促進作用及Th2型細胞因子的抑制作用更為顯著，使Th1/Th2 平衡向Th1 方向漂移，可升高脾臟指數。由于本實驗中對荷瘤兔模型各項指標的觀察受限于生存期，單純艾迪注射液、艾迪注射液和紫杉醇注射液聯合使用是否能夠持續使Th1/Th2 的平衡向Th1 方向漂移，是否可以改善荷瘤兔的生存質量，延長生存期，改善荷瘤兔的免疫微環境還有待進一步的研究。

綜上所述，本研究工作旨在探索艾迪注射液在舌鱗癌治療中發揮的免疫調節作用，結果發現，艾迪注射液通過調節機體內Th1/Th2型細胞因子的平衡來達到治療舌鱗癌的目的，進而起到改善機體的綜合免疫狀態的功效，為艾迪注射液在舌鱗癌治療中進一步研究其作用機理和臨床聯合化療的應用提供了一定的理論依據。