黃芩原藥材、藥渣的黃芩苷含量測(cè)定及體外抗菌活性研究

戴碧鑫， 董碧蓮， 蔡延渠， 朱盛山

（1.廣州白云山星珠藥業(yè)有限公司 廣東廣州 510931；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心 廣東廣州 510006）

黃芩為唇型科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的根，黃酮類化合物黃芩苷為其主要活性成分。其作為傳統(tǒng)藥用植物具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1]。中藥渣是指中藥提取活性成分后的殘留物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中藥渣的年排放量高達(dá)3 000萬噸[2-3]。國(guó)內(nèi)90%以上的生產(chǎn)廠家將藥渣作為廢料垃圾，對(duì)藥渣采取堆、焚燒和掩埋等，這不僅會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染，也會(huì)造成中藥渣資源的極大浪費(fèi)[3-4]。中藥渣經(jīng)提取后，其活性成分約剩余30%殘留在藥渣中。有文獻(xiàn)表明用相同工藝提取黃芩原藥材及其殘?jiān)械狞S芩苷，其中70.3%的黃芩苷未被提取，遺留在了黃芩藥渣中[4]。黃芩為北藥中的重點(diǎn)藥材，以黃芩為主要原料的制藥廠每年都會(huì)產(chǎn)生大量的黃芩提取廢渣，這些廢棄藥渣并未得到很好的處置和利用，仍然作為一種廢棄物而被遺棄[1，4]。為此，筆者對(duì)黃芩及其提取藥渣中的黃芩苷含量及體外抗菌活性進(jìn)行測(cè)定，旨在為黃芩藥渣的后期研究利用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器、藥品與細(xì)菌UV1700-紫外可見分光光度計(jì)、BP211D 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）。黃芩苷（由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，含量93.3%，批號(hào)：110715-201318）；黃芩（批號(hào)：Y1903009）、黃芩藥渣1（克感口服液復(fù)方提取藥渣，批號(hào)：Y1904035）、黃芩藥渣2（單味藥提取藥渣，批號(hào)：Y1904028）由廣州白云山星珠藥業(yè)有限公司提供；中藥復(fù)方NZ（為民間驗(yàn)方，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方NZ有很強(qiáng)的抗菌作用，本實(shí)驗(yàn)室已將其提取物研制成現(xiàn)代制劑[5-6]）為實(shí)驗(yàn)室自制。副溶血弧菌為本實(shí)驗(yàn)室菌種；大腸桿菌由廣州微生物所提供，編號(hào)：ATCC25922；肺炎克雷伯菌由廣州微生物所提供，編號(hào)：ATCC10031。

1.2供試品的制備

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取50 ℃干燥至恒質(zhì)量的黃芩苷對(duì)照品10.25 mg，置于100 mL 容量瓶中以無水乙醇定容，再取1 mL加無水乙醇定容至10 mL容量瓶中得10.25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.2.2 黃芩樣品溶液的制備 精密稱取過40目篩的黃芩粉末50 g，用8 倍量體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取1 h，提取液抽濾后于60 ℃減壓濃縮至1 g/mL的浸膏。

1.2.3 黃芩藥渣樣品溶液的制備 分別精密稱取過40目篩的黃芩藥渣1、黃芩藥渣2粉末50 g，用8 倍量體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取1 h，提取液抽濾后60 ℃減壓濃縮至1 g/mL的浸膏。

2 方法與結(jié)果

2.1黃芩苷含量測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述對(duì)照品液4、5、6、7、8、9 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，各加無水乙醇至刻度，應(yīng)用紫外—可見分光光度計(jì)于波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定其吸光度（D），D（278 nm）為縱坐標(biāo)，黃芩苷的質(zhì)量濃度[ρ/（μg·mL-1）]為橫坐標(biāo)，結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。經(jīng)線性回歸，回歸方程為Y= 0.073 8X- 0.040 7 ，R2= 0.997 1，表明黃芩苷在4 ～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度考察 取黃芩苷對(duì)照品溶液（10.25 μg/mL）5 mL 各5 份，分別置于10 mL 容量瓶中加無水乙醇定容。以無水乙醇為空白，測(cè)定278 nm波長(zhǎng)處的D值分別為0.339、0.332、0.337、0.335、0.337、0.336，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）。結(jié)果顯示sR為0.64%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性考察 取黃芩苷對(duì)照品溶液（10.25 μg/mL）5 mL 置于10 mL 容量瓶中加無水乙醇定容，測(cè)定在室溫下放置1、2、4、8、12、24 h 后278 nm波長(zhǎng)處的D值分別為0.340、0.335、0.337、0.339、0.337、0.336，計(jì)算得sR為0.50%。說明溶液24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，不影響含量測(cè)定。

2. 1. 4 加樣回收試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品，分別加入一定量的黃芩苷對(duì)照品貯備液，按照含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示：平均回收率為99.13%，sR=0.25%。見表2。

2.1.5 供試品中黃芩苷含量測(cè)定 吸取樣品浸膏0.5 mL于50 mL容量瓶中加無水乙醇定容后再吸取0.5 mL 樣品至50 mL 容量瓶中定容，0.45 μm 濾頭過濾后于278 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值，每個(gè)樣品平行3次操作。黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=[（黃芩苷質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)）/黃芩生藥質(zhì)量濃度]。結(jié)果見表3。

表1 不同濃度黃芩苷的吸光度Table 1 Optical density of different concentrations of baicalin （n=6次）

圖1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of baicalin

表2 加樣回收試驗(yàn)Table 2 Sample recovery test （n=3次）

表3 黃芩苷的含量測(cè)定Table 3 Determination of baicalin content（n=3次）

黃芩藥渣1為克感口服液黃芩提取藥渣，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)65%乙醇提取2 次后再與復(fù)方藥材金銀花、荊芥等一起水提2 次。黃芩藥渣2 為單方經(jīng)2 次水提取藥渣。通過測(cè)定得黃芩原藥材、黃芩藥渣1、黃芩藥渣2 的黃芩苷含量分別為4.91%、2.05%、2.25%，其中黃芩藥渣1、黃芩藥渣2未被提取的黃芩苷分別高達(dá)41.75%、45.82%。

2.2體外抗菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 菌種活化和菌懸液制備 將冷藏保存的菌種在瓊脂板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h 進(jìn)行復(fù)蘇，用生理鹽水將菌洗下得菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷岱ǖ?×106CFU/mL菌懸液。

2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用二倍稀釋法，按無菌操作吸取藥液和菌懸液各100 μL 置于96 孔板第1 ～11 孔中，第12 孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μL 作為陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示中藥復(fù)方NZ的抑菌作用較好，故選擇中藥復(fù)方NZ作為陽性對(duì)照藥[6-7]。將96板置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)20 h，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度為該試菌的MIC值。結(jié)果見表4。

2.2.3 抑菌圈直徑測(cè)定 選用直徑為5 mm的新華1號(hào)定性小圓片濾紙，高壓滅菌（121 ℃，30 min），置溫箱烘干。每片濾紙上滴加20 μL 供試品藥液，置溫箱中37 ℃烘干，以中藥復(fù)方NZ作為陽性對(duì)照藥。將藥敏片貼放于含菌的瓊脂平板表面，各紙片中心相距約24 mm，紙片距平皿邊緣約15 mm，各紙片間距離相等，置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，計(jì)算平均值。結(jié)果見表4。

表4 體外抗菌結(jié)果Table 4 In vitro antibacterial results

3 討論

本研究采用紫外—分光光度法測(cè)定黃芩原藥材、黃芩藥渣中黃芩苷含量，二倍稀釋法、紙片法分別測(cè)定黃芩原藥材、黃芩藥渣對(duì)副溶血弧菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌的MIC、抑菌圈直徑。結(jié)果顯示，復(fù)方提取黃芩藥渣1、單方提取黃芩藥渣2中黃芩苷含量及MIC值相差不大，黃芩藥渣1、黃芩藥渣2 未被提取的黃芩苷分別高達(dá)41.75%、45.82%，以黃芩苷含量為指標(biāo)來看，提取后的黃芩藥渣尚有很好的利用價(jià)值。

同種藥材對(duì)不同的菌株抗菌效果不同。黃芩原藥材對(duì)副溶血弧菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌有較好的抗菌作用，尤其是對(duì)副溶血弧菌；黃芩藥渣1、黃芩藥渣2 對(duì)副溶血弧菌有較好的抗菌作用，但是對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌的抗菌作用較弱。黃芩原藥材與黃芩藥渣中黃芩苷含量只相差不到2倍，但是，對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌的MIC值相比相差大于39倍，甚至黃芩藥渣對(duì)該2種菌株的抑菌圈直徑為零，故推測(cè)黃芩的抗菌作用可能與黃芩苷含量的多少無關(guān)，而與含有其他抗菌活性較強(qiáng)的有效物質(zhì)有關(guān)，如文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道黃芩素、黃芩皂苷等具有較好抗菌作用。