基于ITS2鑒別黃草烏及其近緣種摻混

朱高倩， 周培軍， 王麗， 李雙良， 馬莉， 符德歡

（1.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；2.云南白藥集團創(chuàng)新研發(fā)中心，云南昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南昆明 650111）

黃草烏為毛茛科烏頭屬植物黃草烏（Aconitum vilmorinianumKomarov）的干燥塊根，是西南地區(qū)傳統(tǒng)烏頭類藥材之一，被收載于《云南省中藥材標準》（2005 年版）、《重慶市中藥飲片炮制規(guī)范》（2006年版）[1-2]。分布于云南中部和西部、四川（會理）及貴州西部[3-4]。該藥材目前有栽培資源和野生資源，雖然有研究者對其栽培技術(shù)進行了長期摸索，并逐漸研發(fā)了規(guī)范化種植技術(shù)[5-7]，但其技術(shù)推廣尚未完全普及，加之云南省境內(nèi)烏頭種類繁多[3]，導致市售藥材市場中部分黃草烏藥材可能存在摻混現(xiàn)象，而烏頭屬內(nèi)不同物種化學成分種類、含量存在不同程度的差異[8-10]，摻混的黃草烏經(jīng)過統(tǒng)一的炮制方法制黃草烏后，其有效成分（或有毒成分）含量均一性則難以保證，因此，黃草烏的摻混鑒別對確保制黃草烏入藥相關(guān)成方制劑生產(chǎn)具有重要意義。

研究者已對黃草烏藥材從種源、性狀、顯微、理化以及分子生物學方面進行了部分研究[11-12]，目前其顯微鑒別被收錄在《云南省中藥材標準》（2005年版）中的【鑒別】項中[1]，但此方法在實際應(yīng)用過程中有一定的局限性，尤其是在非完整性狀的大批藥材摻混鑒別方面很難進行應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)可應(yīng)用于該藥材摻混鑒別的技術(shù)手段。本研究根據(jù)《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）（2015 年版四部）[13]“中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導原則”，以黃草烏及其近緣種為主要研究對象，開發(fā)黃草烏摻混鑒別技術(shù)，以期為藥材產(chǎn)地、市售烏頭類藥材摻混鑒別提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料試驗材料包括DNA條形碼研究用試驗材料和黃草烏摻混鑒別試驗材料。黃草烏及其近緣物種ITS2 序列特征研究用材料包括16 個黃草烏居群、5 個長喙烏頭居群、2 個馬耳山烏頭居群的葉片或干燥根莖，試驗材料對應(yīng)原植物標本均經(jīng)中國科學院華南植物園楊親二研究員及中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定，標本均存貯于云南省藥物研究所標本室，其中，葉片經(jīng)硅膠干燥保存。具體來源信息見表1。

表1 黃草烏及2個近緣種烏頭的來源信息Table 1 Source information of A.vilmorinianum and its two related Aconitum species

黃草烏摻混鑒別樣品即黃草烏與長喙烏頭、馬耳山烏頭根莖生品進行不同比例的兩兩混合，具體見表2。

表2 不同比例黃草烏與其他2種烏頭混合樣品Table 2 The different proportions of A.vilmorinianum adulterated with its two related Aconitum species

1. 2試劑2 × 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（1.4 mol/L NaCl）提取緩沖液、2×Es Taq MasterMix（Dye），購自北京康為世紀生物科技有限公司；引物，由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成；4S Green Plus 無毒核酸染料，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3儀器Mastercycler PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）；ZF-258全自動凝膠成像分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.4方法

1.4.1 DNA提取 采用改良CTAB[14]提取3種烏頭葉片或根莖材料DNA。

1. 4. 2 PCR 擴增 采用引物ITS2F/ITS2R 對提取DNA 進行PCR 擴增。引物由華大基因合成，引物序列同《中國藥典》（2015 年版四部）[13]，ITS2F：5’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS2R：5’-G ACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。反應(yīng)體系為50 μL，其中含雙鏈DNA 模板2 μL，正反引物（濃度 為10 pmol/L）各0.2 μL， 2 × Es Taq PCR MasterMix（Dye）25 μL，ddH2O 22.6 μL。ITS2 位點的PCR 擴增條件： 94 ℃預(yù)變性4 min。進入循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，30 個循環(huán)。72 ℃終延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在ZF-258全自動凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察拍照。

1.4.3 PCR 產(chǎn)物序列測定及序列分析 PCR 擴增產(chǎn)物直接送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。用DNAMAN、Bioedit 軟件進行序列比對，基因區(qū)段通過NCBIBLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行確定。MEGA 5.1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表3 12個產(chǎn)地的黃草烏性狀特征Table 3 The characteristics of A.vilmorinianum from 12 habitats

2 結(jié)果與分析

2.1不同產(chǎn)地黃草烏性狀比較考察了其中12個產(chǎn)地的黃草烏藥材性狀，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的黃草烏藥材性狀差異較大，主要表現(xiàn)為根莖形狀、長和直徑，表面顏色，斷面顏色等（見表3、圖1）。根莖呈橢圓球形或胡蘿卜形，有時末端稍彎曲，長35.72 ～141.30 mm，直徑6.40 ～20.53 mm。表面呈褐色、黃褐色、灰褐色、深褐色、棕色或深棕色不等，具多數(shù)褶皺或縱溝紋。質(zhì)堅硬，能折斷，斷面淡黃色、灰白色、灰黃色或灰褐色，粉性。

圖1 黃草烏性狀特征Figure 1 The characteristics of A.vilmorinianum

2.2黃草烏及其2個近緣種的ITS2序列比較采用引物ITS2F/ITS2R對黃草烏及其近緣種共計88個樣品提取的DNA 進行PCR 擴增。結(jié)果顯示，黃草烏、長喙烏頭、馬耳山烏頭的ITS2 片段長度均為208 bp，三者的種內(nèi)K2P 遺傳距離分別為0.000 ～0.010、0.000 ～0.010、0.000 ～0.019；黃草烏與長喙烏頭的種間K2P 遺傳距離為0.005～0.019，明顯大于各自的種內(nèi)K2P 遺傳距離；黃草烏與馬耳山烏頭的種間K2P遺傳距離為0.010 ～0.029，大于等于黃草烏種內(nèi)K2P 遺傳距離，但不大于馬耳山烏頭種內(nèi)K2P 遺傳距離（見表4）。從序列比對結(jié)果看，16 個產(chǎn)地黃草烏的ITS2 片段長度為208 bp，在第113 bp、第185 bp、第191 bp 處分別有G/T、A/C、G/A 變異；長喙烏頭和馬耳山烏頭的ITS2 長度也為208 bp，其中在第93 bp、第157 bp、第196 bp處為長喙烏頭的種內(nèi)變異，在第57 bp、第62 bp、第76 bp、第141 bp、第182～183 bp處為馬耳山烏頭的種內(nèi)變異。16個產(chǎn)地黃草烏在ITS2位點的第169 bp、第201 bp 處為C、C，長喙烏頭為T、C，馬耳山烏頭為C、T，通過這兩個位點可將黃草烏與長喙烏頭、馬耳山烏頭進行鑒別（見表5）。

表4 黃草烏及其2個近緣種ITS2序列的遺傳距離Table 4 Genetic distance of A.vilmorinianum and its two related Aconitum species in ITS2 sequence

表5 不同產(chǎn)地黃草烏及其近緣種居群ITS2差異位點表Table 5 Difference in ITS2 locus of A.vilmorinianum from different habitats and its two related Aconitum species

（續(xù)表5）

2.3黃草烏及其2個近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析以黃草烏及其2 個近緣種的序列比對結(jié)果構(gòu)建NJ 樹（見圖2），可見馬耳山烏頭單獨聚為1 個大支，黃草烏和長喙烏頭在1 個大支上。而16 個產(chǎn)地黃草烏又聚為1個亞支（下分為3個小支），長喙烏頭為另1個亞支。說明ITS2位點上，黃草烏與長喙烏頭遺傳距離較近，而與馬耳山烏頭較遠。ITS2 位點可將黃草烏與長喙烏頭、馬耳山烏頭完全鑒別開。

2.4不同比例黃草烏及其種混合樣品ITS2峰值圖特征黃草烏與長喙烏頭、馬耳山烏頭粉末混合樣品的ITS2序列峰值圖（見圖3）表明，在ITS2的第169 bp處，當黃草烏與長喙烏頭粉末混合比例為1∶1或1∶2 時，“T”堿基峰值高于“C”堿基峰值，呈現(xiàn)長喙烏頭純樣品相似峰值。而當黃草烏與長喙烏頭比例為2∶1 時，則顯示“T”堿基峰值高于“C”堿基峰值，呈現(xiàn)黃草烏純樣品相似峰值。在ITS2 的第201 bp 處，黃草烏與馬耳山烏頭粉末混合比例為1∶1 或1∶2 時，“T”堿基峰值均高于“C”堿基峰值，呈現(xiàn)馬耳山烏頭純樣品相似峰值，比例為2∶1 時，“C”堿基峰值則高于“T”堿基峰值，呈現(xiàn)黃草烏純樣品相似峰值。

圖2 不同產(chǎn)地黃草烏及其近緣種ITS2位點系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 The phylogenetic tree for ITS2 locus of A.vilmorinianum from different habitats and its two related Aconitum species

3 討論

3.1栽培黃草烏性狀差異大難以穩(wěn)定鑒別隨著黃草烏栽培技術(shù)的發(fā)展[5-7]，云南省很多區(qū)域都進行了黃草烏的規(guī)模化栽培，但其種源、種苗質(zhì)量目前暫未完全形成標準規(guī)范，導致不同地域種植的黃草烏藥材質(zhì)量存在一定差別。在藥材市場上，黃草烏以其根莖進行交易。云南省境內(nèi)烏頭種類繁多[3]，其混淆藥材來源為野生資源或栽培資源。《云南植物志》記載黃草烏為纏繞藤本植物，塊根為橢圓形或胡蘿卜形，與其相似的物種不在少數(shù)[3]。在云南境內(nèi)長喙烏頭也具有一定規(guī)模的栽培資源，其內(nèi)含有2005 年版、2010 年版《中國藥典（二部）》收載的草烏甲素[13]，是草烏甲素提取的潛在植物資源，其塊根與黃草烏相似，為胡蘿卜形[3]，此類摻混有時給藥材收購造成很大困難。本研究中16 批黃草烏根莖長、直徑、表皮顏色等特征均表現(xiàn)為有較大差異，尤其是其大小普遍比《云南植物志》[3]所述的“長2.5 ～7 厘米，粗1 厘米”更大、更粗壯，其原因可能與產(chǎn)地的環(huán)境、栽培方式、施肥力度等[15-18]有關(guān)，難以作為穩(wěn)定的鑒別指標。

圖3 不同比例黃草烏及其近緣種摻偽的ITS2峰值圖特征Figure 3 ITS2 peak value characters in the adulteration of A.vilmorinianum with different proportions of its two related Aconitum species

3.2基于ITS2鑒別黃草烏摻混具有一定可行性目前對烏頭屬的分子鑒別多集中于系統(tǒng)發(fā)育分析[15-16]，其針對某個種的樣本量較為局限，對于栽培烏頭藥材的鑒別有一定的參考價值。而對于ITS位點在烏頭屬的鑒別，有研究者對川烏、草烏、紫烏頭、黃草烏、滇南草烏等都進行過ITS位點的研究[12，17-20]，其相互間的對比鑒別多局限于個別中有限個體之間進行比較，尚需完善烏頭栽培資源的來源范圍。本研究基于既往研究基礎(chǔ)上，采用ITS2 序列可用于鑒別黃草烏、長喙烏頭和馬耳山烏頭居群，結(jié)果與既往研究結(jié)果相似，ITS2對于3種烏頭的鑒別效果較為明顯；而16 個產(chǎn)地的黃草烏ITS2 還表現(xiàn)為較為保守序列，說明穩(wěn)定性相較于多變且受外部環(huán)境影響的性狀，ITS2 更適用于黃草烏藥材的鑒別。在此基礎(chǔ)上，本研究對黃草烏與長喙烏頭、馬耳山烏頭的混合粉末樣品也進行了探究，結(jié)果表明ITS2 位點對于長喙烏頭或馬耳山烏頭摻偽樣品中黃草烏占比為1/2、1/3時可檢測出摻偽，當黃草烏占比為2/3 時則檢測不出摻偽。此結(jié)果與前人利用ITS鑒定不同比例的人參和西洋參效果相似[21]，即當摻偽物在混合物中占比較大時如本研究中偽品占一半以上，此法有效；相反，正品在混合物中占較大時，此法容易失效。

本研究目前雖然用ITS2 可鑒別黃草烏與長喙烏頭、馬耳山烏頭，但鑒于烏頭屬種類繁多[2]，藥材市場上充斥著的烏頭屬混淆藥材遠不止已研究的物種，ITS2 對黃草烏的鑒別可能還存在有局限性。在未來工作中還可結(jié)合其他位點如在人參屬利用ITS、18S和matK的多重位點特異性PCR法鑒別人參、三七、西洋參摻雜[22]，也可用其他類型的DNA 分子標記，如用EST-SSR、EST-SNP 標記結(jié)合高分辨率熔解曲線和焦磷酸測序分析技術(shù)鑒別金銀花摻偽情況[23]，或是參考其他學科領(lǐng)域的技術(shù)如FTIR 多級圖譜鑒別山茱萸摻偽[24]等相關(guān)技術(shù)對黃草烏進行系統(tǒng)鑒別，以期不斷確保黃草烏基原正確、藥材質(zhì)量均一，從而達到安全用藥的目的。