藥物致橫紋肌溶解的動物實驗研究*

裴 佩 鹿雙雙 汪聿坤 胡艷欣 盧選成 王 銳 路 凱

(1.中國疾病預防控制中心，北京 102206)(2.中國農業大學，北京 100193)

橫紋肌溶解(Rhabdomyolysis，RM)是多種原因引起的橫紋肌細胞膜完整性破壞、肌肉組織溶解，細胞內電解質、肌紅蛋白(Myoglobin，MYO)、酶類如肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)、醛縮酶、乳酸脫氫酶、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)等釋放入血，臨床可表現肌肉組織壞死，肢體疼痛、腫脹、功能障礙，往往伴有血尿，嚴重者可出現急性腎功能衰竭，甚至多臟器衰竭[1-3]。目前明確的導致RM的病因可分為獲得性因素及遺傳性因素兩大類，還有很大一部分病因不明確。哈夫病就是一種由于進食加工后的淡水、海水產品后24 h內突然發生的RM[4]，該病首次報道于1924年，至今病因不明，有關研究推測，病例進食的水產品中可能存在一種耐高溫的未知致病因子，經口攝入后導致了RM的發生[4]。為了篩選可能含有致病因子的食物樣本，為哈夫病病因研究提供線索，須進行動物實驗。而目前研究RM的動物實驗多采用50%的甘油溶液肌肉注射導致RM的動物模型[5]，是一種創傷性RM動物模型，直接損傷肌細胞致病，不適用于哈夫病等非創傷性RM的研究。在非創傷性RM中，約50%的病例因服用藥物發病[6]，與哈夫病經口攝入而致病的特點相似。我國2000—2018年藥源性RM的統計分析顯示，他汀類藥物引發RM的病例數量最高，占61.06%，與貝特類藥物聯合使用時RM發生率會升高[7]。因此，本研究通過對Wistar大鼠、ICR小鼠給予辛伐他汀(Simvastatin，SMV)、吉非羅齊(Gemfibrozil,GF)兩種藥物，觀察聯合給藥及單獨給藥引起肌肉損傷等生化指標水平的變化情況，篩選出可發生橫紋肌溶解的動物，為后續進行哈夫病等病因不明的RM提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠5周齡雌性21只、雄性45只，SPF級ICR小鼠5周齡雌性21只，雄性45只，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002，大鼠2只/籠，小鼠5只/籠，飼養在22～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%，換氣次數15次/h，照明時間12 h的負壓屏障動物實驗設施中，許可證編號：SYXK(京)2017-0021。動物實驗方案經中國疾病預防控制中心實驗動物福利倫理委員會審核批準(批準文號：2019-CCDC-IACUC-004, 2019-CCDC-IACUC-016)，每次實驗前動物在設施內適應性飼養7 d，實驗期間給予60Co照射滅菌鼠全價顆粒(維持料)飼料及實驗動物飲用水，實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

吉非羅齊膠囊(廣東彼迪藥業有限公司，批號：H44021201)；辛伐他汀膠囊(湖北舒邦藥業有限公司，批號：H20000107)；羧甲基纖維素鈉(上海嘉禾生物科技有限公司)；大鼠、小鼠肌紅蛋白酶聯免疫分析試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號：ML720372)；肌酸激酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶測定試劑盒(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，批號：141518012)。邁瑞BS-240VET全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；PHOMO酶標儀(安圖生物公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1藥物的配置及劑量設置:SMV臨床成人每日最大攝入量為40 mg/d，GF臨床成人用量為600 mg/d，根據藥理實驗動物間與人體間劑量換算方法[8]及種間差異，得到20 g(標準體質量)小鼠SMV等效劑量為80 mg/kg，GF等效劑量為1200 mg/kg，150 g(標準體質量)大鼠SMV等效劑量為40 mg/kg，GF等效劑量為600 mg/kg。SMV及GF用0.5%CMC制成混懸液。

1.3.2實驗動物分組及給藥方法:

1.3.2.1不同性別動物進行不同劑量SMV、GF聯合給藥實驗

將大鼠、小鼠各42只，雌雄各半，按種屬、性別分開，隨機分為4組：低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組，其中高劑量組12只，其余各組10只，劑量如表1。采用灌胃給藥的方式，每天給藥1次，持續給藥14 d。大鼠、小鼠均于7 d、14 d給藥后24 h采集血液。

表1 不同劑量SMV、GF聯合給藥實驗分組劑量Table 1 Dosage regime of different dose SMV and GF-administered animals

1.3.2.2SMV、GF聯合給藥、單獨給藥實驗:將雄性大鼠、小鼠各24只按種屬分開后，隨機分成4組，SMV&GF組、SMV組、GF組、對照組，分組及給藥劑量見表2。每天灌胃給藥1次，持續給藥14 d。小鼠于給藥前、給藥7 d、14 d后24 h采集血液，大鼠于給藥前、給藥3 d、6d、8 d、10 d、12 d、14 d后24 h采集血液。

1.3.3血液樣本采集:在麻醉機中加入異氟烷，旋轉調節氧氣流量計前端的氣源閥門，使輸出的氣體達到所需要的流量(大鼠500～700 mL/min，小鼠300～500 mL/min)，打開麻醉機蒸發器，調節誘導濃度為4%，待異氟烷充滿誘導盒后，將動物放入，等待2～3 min，待動物完全麻醉，從誘導盒取出，左手固定鼠，壓迫頸部使其眼球充分外凸，右手持毛細玻璃管自內眥插入眼瞼與眼球之間，略加捻轉，使血液自毛細管流入ep管中。大鼠采血量為1 mL，小鼠為0.5 mL。將血液于4 ℃冰箱放置過夜，4 ℃ 5 000 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃凍存。

1.3.4血清生化檢測：使用邁瑞BS-240VET全自動生化分析儀測定收集到的血清中CK、ALT、AST含量。使用鼠源MYO酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒，體外定量檢測鼠血清中MYO表達水平(雙抗體夾心法)。具體的操作方法嚴格遵循試劑盒說明書進行操作。

表2 SMV、GF聯合給藥、單獨給藥實驗分組劑量Table 2 Dosage regime of SMV- and/or GF- administered animals

1.3.5組織學檢查：在最后一次采血后對動物實施二氧化碳安樂死，取左后肢的股骨直肌、股二頭肌和腓腸肌三個部位骨骼肌，置于10%甲醛固定液中固定。骨骼肌標本在10%甲醛固定液中固定至少24 h，選取CK值高于參考值上限5倍及發生步態不穩、后肢無力或癱瘓等行為學改變的動物肌肉標本，進行蘇木精-伊紅(HE)染色查看橫紋肌溶解情況。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 大鼠RM發生情況

2.1.1不同性別、不同劑量組大鼠聯合給藥血清CK、ALT、AST的表達水平

給藥14 d后，低劑量組大鼠的血清CK、ALT、AST與對照組相比顯著升高(P<0.05)(表3)，雌性大鼠、雄性大鼠之間的差異不具有統計學意義(P>0.05)。其中低劑量組雄性大鼠有2只CK明顯升高，1只出現行為學改變(CK值3035.96 U/L)，另一只CK值高于參考值上限5倍(CK值4734.72 U/L)。根據這項結果，在后續不同藥物實驗中采用SMV 20 mg/kg&GF 600 mg/kg這一劑量給藥。考慮到性別無顯著性差異，為了避免雌性發情周期對生化指標測定的影響，選擇雄性大鼠。

表3 不同性別、不同劑量組大鼠血清CK、ALT、AST的表達水平Table 3 serum CK, ALT,AST levels in different SMV dose administered male or female Wistar rats

2.1.2不同藥物組大鼠血清CK、MYO、ALT、AST的表達水平及變化趨勢

所有大鼠的CK值均未達到參考值上限5倍，也未觀察到明顯的后肢無力等行為學改變。各組的血清CK、MYO、ALT、AST水平及變化趨勢見圖1、表4。

與給藥前相比，SMV&GF組大鼠血清CK水平在給藥10 d后顯著升高(P<0.05)，達到峰值(1171.20±250.79 U/L)，而后一直保持在較高水平，CK水平在給藥6 d、10 d、12 d較同時間點對照組升高，差異顯著(P<0.05)。血清MYO水平在給藥后稍有上升，給藥第14天達峰值，但差異不具有統計學意義，給藥6 d、8d與同時間點對照組相比降低(P<0.05)。ALT與AST給藥10 d后開始顯著升高，給藥6 d、10 d、12 d、14 d時均高于對照組(P<0.05)。

圖1 不同藥物組大鼠血清CK、MYO、ALT、AST水平變化趨勢Fig.1 Time-dependent changes of serum CK, MYO,ALT, and AST levels in

表4 不同藥物組間大鼠血清CK、MYO、ALT、AST的表達水平Table 4 Effects of SMV and GF administration serum CK, MYO, ALT, and AST levels in rats

SMV組大鼠血清CK水平波動較大，在給藥3 d后達到峰值(1789.62±508.03 U/L)，與給藥前相比差異有統計學意義(P<0.05)，但在給藥6 d后降至最低(464.57±202.36 U/L)，之后又緩慢上升，第10天達第二高峰，CK水平在給藥3 d及8d、10 d、12 d較相同時間點對照組升高(P<0.05)。血清MYO水平在給藥前后的差異不具有統計學意義，與對照組相比，給藥6 d，8 d，12 d時低于對照組(P<0.05)。血清ALT給藥3 d時出現一過性升高(P<0.05)，且高于對照組(P<0.05)。血清AST水平同樣在給藥3 d時一過性升高(P<0.05)，隨后降低，與對照組相比，給藥3 d、8 d、10 d時AST顯著升高(P<0.05)。

GF組大鼠血清CK給藥3 d后一過性升高(P<0.05)，給藥6 d后與對照組相比有所上升(P<0.05)。血清MYO給藥前后差異無統計學意義(P>0.05)，給藥3 d、6 d、8 d、12 d時低于對照組(P<0.05)。血清ALT、AST給藥3 d時高于給藥前，且高于對照組(P<0.05)。

2.1.3大鼠骨骼肌肉組織病理學變化

對1只對照組大鼠、1只血清CK水平超過參考值上限5倍(CK值4734.72 U/L)的SMV&GF組大鼠、1只出現后肢無力表現(CK值3035.96 U/L)的SMV&GF組大鼠所采集骨骼肌標本進行HE染色病理檢查。對照組大鼠(圖2-A-2)骨骼肌細胞呈長形，可看到交錯的橫紋；出現行為學改變的大鼠(圖2-C-1，圖2-C-2)肌纖維嚴重壞死、消失，肌纖維間可見大量的淋巴細胞、多核巨細胞、巨細胞、嗜中性粒細胞等炎性細胞浸潤；CK值超過參考值上限5倍的大鼠(圖2-B-1，圖2-B-2)病理檢查未見明顯異常。

圖2 大鼠骨骼肌病理變化(HE染色)Fig.2 Histological examination of the skeletal muscle in rats(HE staining)

2.2 小鼠RM發生情況

2.2.1不同性別、不同劑量組聯合給藥小鼠血清CK、ALT、AST的表達水平

給藥14 d后，中劑量組雄性小鼠的血清CK水平與對照組相比有所升高(P<0.05)，不同性別的小鼠間CK、ALT水平差異具有統計學意義(P<0.05)，雄性小鼠高于雌性小鼠。根據這項結果，在不同藥物給藥實驗中均采用SMV80 mg/kg&GF1 200 mg/kg這一劑量對雄性小鼠進行實驗。其中，3只小鼠CK值超過參考值上限的5倍，均為低劑量組雄性小鼠；所有小鼠均未觀察到明顯行為學改變。

表5 不同性別、不同劑量組小鼠血清CK、ALT、AST的表達水平Table 5 Serum CK、ALT、AST levels in different SMV dose administeredmale or female ICR mice

2.2.2不同藥物組小鼠血清CK、MYO、ALT、AST的表達水平及變化趨勢

由圖3可知，SMV&GF組小鼠血清CK水平在給藥后持續升高，給藥14 d達到峰值，血清MYO水平在給藥14 d較給藥前稍有上升，血清ALT、AST給藥第7天后稍有降低，并于給藥14 d上升，但與給藥前相比差異不具有統計學意義(P>0.05)。SMV組與GF組小鼠的血清CK、MYO、ALT、AST給藥前后差異不具有統計學意義(P>0.05)。不同給藥組小鼠與對照組相比血清CK、ALT、AST水平差異無統計學意義(P>0.05)，SMV&GF組、SMV組小鼠給藥14 d時血清MYO水平較對照組升高(P<0.001)，其他血清指標結果無顯著性差異(P>0.05)。血清CK值高于參考值上限5倍的小鼠有2只，均為SMV&GF組小鼠(2430.17 U/L,3245.16 U/L)，但同組的其余4只小鼠CK值均未升高。所有小鼠均未觀察到行為學改變，見表6。

表6 不同藥物組小鼠各時間點血清CK、MYO、ALT、AST的表達水平Table 6 SMV and GF administrationon serum CK, MYO, ALT, and AST levels in mice

圖3 不同給藥組小鼠血清CK、MYO、ALT、AST水平變化趨勢Fig.3 Time-dependent changes of serum CK, MYO,ALT and AST levels in

3 討論

藥物因素在RM獲得性非創傷性病因中占很大一部分[9-10]，通過動物實驗研究，篩選出能發生藥物相關RM的實驗動物，對研究非創傷性RM如哈夫病具有參考價值。本研究選擇SMV、GF兩種藥物探索在不同性別的ICR小鼠、Wistar大鼠中造成RM的情況，發現Wistar大鼠在SMV、GF聯合給藥時肌酸激酶升高，發生肌肉損傷，為后續進行哈夫病動物實驗提供了參考，也為建立藥物相關RM動物模型奠定了基礎。

目前臨床中導致RM的藥物主要是用作降脂的他汀類藥物，即HMG-CoA還原酶抑制劑，包括SMV、普伐他汀、洛伐他丁、阿托伐他汀等，常與貝特類抗高三酰甘油藥物聯合用于治療混合型高脂血癥和單一用藥不能控制的高脂血癥[11]。其中，西立伐他汀與貝特類代表藥物GF聯用曾導致了大量病例死亡，迫使西立伐他汀全球撤市[12]。他汀類藥物的肌肉毒性風險由高至低排序依次為西立伐他汀、SMV、洛伐他汀、普伐他汀[13]。因此，本研究采用SMV、GF兩種藥物聯合給藥進行探究。

肌細胞損傷是RM的主要表現，血清中CK、MYO、ALT、AST的含量反映肌細胞內容物入血情況[14-16]。臨床上RM的診斷標準為肌肉疼痛伴有血清CK值上升到參考值上限5倍以上[11]。血清中ALT、AST水平常常升高，MYO會超過血清球蛋白的結合能力，被轉運至腎小球最終隨著尿液排出。本研究通過檢測CK、MYO、ALT、AST的水平來衡量RM的發生情況。結果表明，20 mg/kgSMV和600 mg/kgGF 聯合給藥，Wistar大鼠灌胃10 d后，可以引起大鼠血清CK、ALT、AST水平明顯升高，與給藥前及同時間點對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)；CK水平超過50日齡Wistar大鼠CK值參考值[17]，但未達到臨床RM診斷標準。造成這一結果的原因可能是嚙齒類動物與人類之間對藥物的敏感性不同，且動物的個體差異較大，臨床上CK的參考值為18.0～198.0 U/L，而Wistar大鼠CK參考值為443.22～942.28 U/L，C57/BL6小鼠CK 97.5%置信區間值為377 U/L，嚙齒類動物的CK值比人類高且波動范圍更大。RM臨床診斷標準可能并不能完全適用于實驗動物，在實驗中陰性對照組及基線CK水平的參考十分重要。在給藥6 d后血清CK、ALT、AST與對照組相比有所升高，但在第8天有所下降，可能自給藥第6天起就發生了肌肉損傷，但由于機體自適應及血清肌酶的半衰期，被機體代償清除[18]。單一給予SMV組的大鼠給藥3 d后血清CK、ALT、AST出現了一過性升高，在給藥前血清CK(969.34±602.29 U/L)高于參考值上限，對給藥后的CK造成了一定影響。單一給予GF的大鼠給藥3 d后血清CK、ALT、AST出現了一過性升高，也未能引起大鼠出現穩定的肌肉損傷改變，這與既往GF對SD大鼠未造成明顯肌肉毒性的研究結果是一致的[19-20]。與大鼠相比，小鼠在SMV、GF聯合給藥后，CK值并未普遍升高，單獨給藥也未引起CK升高，小鼠對肌肉毒性藥物不敏感。本研究CK水平并未發現有劑量效應相關性，與流行病學研究發現西立伐他汀臨床用藥肌肉毒性與劑量有相關性[21]這一結論不一致。

本研究中各組MYO值與給藥前相比差異均無統計學意義，與對照組同期相比，甚至有降低的情況，可能是由于血清MYO值受以下因素的影響：一是血清MYO清除速率快于CK，通常在CK值升高前就有所升高并在CK值下降前降至正常[22]。二是本研究中MYO值的測定采用酶聯免疫分析法，溶血可能會造成結果誤差。因此，檢測血清MYO對RM的診斷敏感性不高。

肌肉活檢是確診RM的金標準，但在臨床中并非必須的檢查[23]。本研究中對2只SMV&GF組大鼠骨骼肌進行病理檢查，RM表現檢出率為50%，且CK值高的大鼠并未發現病理改變，說明CK水平與病理損傷程度并非呈正比關系。但值得注意的是，出現行為學改變的大鼠在給藥第4天時觀察到胸口處有鼓包現象，判斷可能是灌胃造成食管損傷所致，后鼓包有所吸收，與同組其他大鼠相比，這只大鼠明顯精神差、毛發亂、活動度降低。灌胃損傷可能加劇了藥物導致的RM癥狀，具體原因還需要進一步的研究。

因為本研究未對所有動物進行統一評分的肌肉病理檢查，不能明確RM的組織學確診情況，因此不能評判SMV、GF聯合給藥在Wistar大鼠中是否成功建立了具有可重復性的藥物相關RM動物模型。但本研究結果顯示Wistar大鼠是建立模型的良好選擇，對藥物表現較為敏感。

綜上所述，本研究通過對兩種性別的Wistar大鼠、ICR小鼠進行藥物因素相關動物實驗研究，大鼠在SMV、GF的聯合作用下，出現了肌酸激酶升高的RM癥狀，在進行哈夫病動物實驗研究時，可考慮使用Wistar大鼠。ICR小鼠對SMV和GF的聯合及單獨給藥作用表現不敏感。