獼猴進行遙測系統植入子植入手術的經驗體會*

盧祺炯 徐 聰 陳靈芳 楊 倩 夏麗娟 楊紅忠 鄭高利

(杭州醫學院安全性評價研究中心，杭州 310053)

安全藥理學研究中，為獲取更加準確的藥物的非期望影響的暴露劑量、暴露時間等信息，使用遙測系統，通過長時間不間斷獲取清醒無束縛動物給藥前后的呼吸、心電、血壓等核心指標數據，經綜合分析與比較，以確認藥物可能的對動物心血管系統與呼吸系統的不良影響，該方法符合中國食品藥品監督管理總局《藥物安全藥理學研究技術指導原則》[1]、ICH S7A《Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals》[2]對安全藥理學研究試驗方法的要求。遙測系統的硬件主要分兩類：一類是依靠植入子監測動物心血管、呼吸系統的數據，該類設備需要對動物進行植入子植入手術，手術恢復后方可開展試驗；另一類是應用無創遙測技術，將傳感器置于動物體表，并用馬甲保護和放置遙測系統設備，此類設備無需進行手術，只需要對動物進行馬甲穿著的訓練篩選依從性好的動物即可開展試驗。在選擇試驗儀器時，應根據供試品特征與試驗要求選擇植入或者無創的方法。

梁春南[3]曾報道犬因傷口開裂后續感染導致植入手術失敗，為了避免本試驗猴術后出現類似的情況，作者根據之前應用Beagle犬進行植入手術出現過的一些異常狀況，根據猴的身體特征，針對性地調整了手術方案、并對可能出現不期望出現的不良反應建立了解決預案，最終全部8只受術猴手術順利完成、術后愈合良好，血液學、生化學指標與心血管系統未顯示感染或炎癥指標，植入子工作正常，并順利地完成了后期的安全藥理學試驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

恒河猴，普通級，年齡3～5歲，體質量3.1～6.5 kg，8只，雌雄各半，由寧波市鄞州東吳天童獼猴養殖場提供，實驗動物生產許可證：SCXK(浙)2013-0027，動物質量合格證號：0002570。飼養于浙江省醫學科學院安全性評價研究中心普通級猴飼養室中，溫度16～26 ℃，相對濕度40%～70%，中央空調集中通風8～10次/h，光照12 h明、12 h暗，實驗動物使用許可證：SYXK(浙)2012-0176。喂飼猴全價顆粒營養飼料，LAWS-2000實驗動物反滲透純水機處理的飲水。經IACUC批準動物使用申請書編號GLP-A-033。

1.2 主要儀器與試劑

DSI電生理遙測系統，植入子型號TL11M3-D70-PCTR，美國DSI公司;Matrix動物麻醉機，美國MIDMARK公司;BayerADVIA 2120血細胞分析儀，西門子公司;日立7100全自動生化儀，日本日立公司;TCS-15電子秤，梅特勒-托利多;注射用頭孢西丁鈉(0.5 g/瓶)，批號：120615，?？谑兄扑帍S有限公司。

雙氯芬酸鈉緩釋膠囊(50 mg)，批號：130105，南京長澳制藥有限公司;戊巴比妥鈉，批號：WS20171005，規格：25 g/瓶，購于上海西唐生物科技有限公司;異氟烷，批號：120204，魯南貝特制藥有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1術前準備工作：猴檢疫結束次日，稱體質量，后肢靜脈抽血樣進行5分類血常規分析與生化學分析，如出現WBC分類異常伴隨體溫偏高的、PLT偏低、PT較長的猴，則請獸醫對癥處理，恢復正常后再行安排手術。術前3 d耳溫計檢測體溫；之后肌注注射用頭孢西丁鈉0.5 g/猴，對動物進行圍手術期抗生素覆蓋處理，連續2 d；術前禁食不禁水12 h以上。預備經清洗、消毒、干燥的猴飼養籠作術后恢復關養用。

1.3.2麻醉方法與麻醉程度的控制：術前后肢靜脈緩慢注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg體質量誘導麻醉，以四肢松弛并且牽拉無反抗、針刺反射消失、眼瞼反射遲鈍為誘導麻醉完成狀態，之后完成備皮、建立靜脈通道、滴注0.5%頭孢西丁鈉注射液(100 mL)等預備工作后手術臺固定，異氟烷吸入維持麻醉。麻醉維持期間不間斷觀察猴麻醉狀態，如猴出現肌張力增加、身體扭動等異常狀況時，應暫停手術操作并增加異氟烷蒸發速度加深麻醉程度，若心率減慢過快同時血壓降低(遙測系統手術時可監測猴血壓和心率)則減少異氟烷的蒸發速度。

1.3.3手術方法：確認猴的麻醉狀態適宜手術之后，即按本機構制定的植入子手術標準操作規程完成植入手術。分別在猴的右側鎖骨下方(與身體縱軸垂直，切開約2 cm)、左右兩側腋下第五對肋骨處(平行身體縱軸，切開約5 cm)、左下腹腹斜肌位置(平行身體縱軸，切開約8 cm)、左后肢股動脈位置(與股骨平行，切開約3 cm)先后作切口。左側腹部腹斜肌鈍性分離開口，在肌層下方鈍性分離出一個可以放置植入子本體的“口袋”，置入植入子后，先后將壓力導管插入左后肢股動脈、心電和呼吸電極導線自皮下建立的通道導引至左右兩側腋下和右側鎖骨下方并固定，完成以上植入操作，肌肉層與皮下組織用4號吸收縫合線分層間斷縫合，皮膚3號吸收縫合線皮內連續縫合，全部切口縫合完畢，經鼻飼灌胃雙氯芬酸鈉膠囊內容物用以術后鎮痛，待0.5%頭孢西丁鈉注射液滴注結束后停止異氟烷吸入。移回猴飼養籠內側臥放置待蘇醒，期間打開植入子電源開關并監測猴心電、血壓等參數，觀察至術后4 h確認無嘔吐、縫合處無開裂與大量滲血，心電、血壓等指標無異常后方可關閉植入子電源并離開。

1.3.4術后觀察與護理：術后次日起，每日觀察并記錄受術猴切口的狀態，出現疑似感染時及時抽取血樣檢查血液學與生化學指標，并給予對癥治療?；謴推陂g鼻飼法灌胃雙氯芬酸鈉膠囊內容物每日1粒，給藥2 d；肌注注射用頭孢西丁鈉0.5 g/d，給藥3 d；每日碘伏擦拭消毒切口至愈合；每日觀察縫合處有無開裂、血腫等異常，如有血腫但縫合處無特殊狀態，可用注射器穿刺至積液處抽取。至術后7 d起，傷口結痂愈合、無水腫的，稱量體質量，抽取血樣進行血液生化檢測，測量耳溫，并開啟遙測系統記錄猴的心電、呼吸、血壓等指標1 h，經分析比較后如各指標正常即認為可進行下一步的安全藥理學試驗。

1.3.5各類檢測指標選擇與比較方法： 血常規選取WBC(白細胞)、RBC(紅細胞)、HGB(血紅蛋白)、PLT(血小板)、NEUT(中性粒細胞)、LYMPH(淋巴細胞)、MONO(單核粒細胞)、EOS(嗜酸性粒細胞)、BASO(嗜堿性粒細胞)、 NEUT(中性粒細胞計數)、LYMPH(淋巴細胞計數)、MONO(單核粒細胞計數)、EOS(嗜酸性粒細胞計數)、BASO(嗜堿性粒細胞計數)進行手術前后比較；生化學選取ALT(丙氨酸轉氨酶)、AST(天門冬氨酸轉氨酶)、TP(總蛋白)、ALB(白蛋白)、TBIL(總膽紅素)、ALP(堿性磷酸酶)、GLU(血糖)、BUN(尿素氮)、Crea(肌酐)進行手術前后比較；心電、呼吸和血壓選取HR(心率)、R-H(R波幅度)、P-H(P波幅度)、T-H(T波幅度)、ST-E(ST位移)、QRS(QRS時程)、PR-I(PR間期)、QT-I(QT間期)、QTcb(校正QT間期)、SYS(收縮壓)、DIA(舒張壓)、Mean(平均壓)、呼吸頻率等指標與獼猴白晝基礎值進行比較；體溫進行手術前后比較。

2 結果

2.1 手術結果

2.1.1術前肌注給予注射用頭孢西丁鈉，對動物實行抗生素覆蓋；應用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg劑量靜脈注射誘導麻醉；術前備皮；異氟烷吸入維持麻醉等試驗操作均順利完成，期間無異常。

2.1.2猴術中出血量少、皮下脂肪少、止血快、術野清晰；皮膚與皮下組織易分離、縫合難度較大，縫合操作量多；吸入維持麻醉的程度易控制，術中猴均未見任何異常。一般在術后30 min內恢復意識開始清醒，開始出現睜眼、轉頭、四肢伸縮等活動，但保持側臥狀態；至術后3～5 h猴可坐或趴臥，活動少；至術后24 h觀察均恢復基本的活動能力，正常攝食飲水。

2.1.3術后護理期間，猴神態、活動、飲食、應激反應均正常，各切口術后愈合良好，至術后7 d均可結束護理，轉至實驗使用，全部猴未見可能因術后恢復不良導致的受術區域的功能異常。術中建立的皮下導管和電極導線通道區域，全部8只猴術后1～2 d均發現至左后肢的壓力導管通道位置均出現短期、程度不一的輕度水腫，但無需干預處理，術后3～5 d水腫全部消失。手術前后猴的平均體質量分別為(4.88±0.76)與(4.86±0.70)kg，n=8，配對t檢驗結果t=0.424(P>0.05)；手術耗時(134～260)min，平均(182.0±43.7)min；蘇醒耗時(12～24)min，平均(17.5±4.1)min；術后活動起始時間為3～5 h，平均(3.6±0.7)h；后肢在術后1～2 d內均出現水腫，平均(1.4±0.5)d；后肢水腫在術后3～4 d均消退，平均(3.8±0.5)d。

2.2 各類指標手術前后檢測結果

2.2.1血常規:對各項5分類血常規指標手術前后配對比較t檢驗發現：除RBC、HGB、LYMPH三項血液學指標術后檢測結果低于手術前之外(P<0.05或P<0.01)，其余指標手術前后相似(P>0.05)，未見明顯變化。詳見表1。

表1 獼猴手術前后血常規指標Table 1 Rhesus monkey’s blood routine indicators before and after surgery

2.2.2生化學：對各項生化學指標手術前后配對比較t檢驗發現：ALT、TP的術后均值低于手術前(P<0.05或P<0.01)，AST的術后均值高于手術前(P<0.05)，其余指標手術前后均相似(P>0.05)，未見明顯變化。詳見表2。

表2 獼猴手術前后生化學指標Table 2 Rhesus monkey's biochemical indicators before and after surgery

2.2.3心電、血壓、呼吸、體溫：受術猴術后第7日應用遙測系統檢測心電、血壓、呼吸等指標，與作者之前獲得的獼猴白晝基礎值[4]進行單樣本t檢驗比較發現，T波幅度與呼吸頻率有少許降低，其余指標手術前后相似，未見明顯變化。詳見表3。

獼猴體溫手術前后測量值分別為(37.3±0.4)℃和(36.9±0.5)℃，配對t檢驗結果n=8，t=1.943，P=0.093，手術前后無顯著性差異。

表3 獼猴手術后心電、血壓、呼吸指標Table 3 Post-operative ECG, blood pressure, and respiratory index of Rhesus monkey

3 討論

3.1 結論

通過獼猴遙測系統植入子植入手術實例，成功實施猴應用遙測系統的手術流程，術后愈合良好，提高了遙測動物模型建模的成功率。對國內機構使用植入式遙測系統建立大動物模型在安全藥理學研究的應用中起到一定的借鑒作用。

3.2 討論

3.2.1猴血液學與生化學指標檢測發現術后RBC、HGB、ALT、TP的均值低于手術前，AST值高于手術前等變化。上述變化中RBC與HGB降低可能與手術期間失血與術后出血有關，ALT的降低變化無臨床意義，但TP降低、AST升高可能與術后愈合過程中創口自修復過程有相關性。呼吸、血壓、心電指標與猴白晝基礎值比較，僅有術后T波幅度、呼吸頻率偏低，考慮大部分心血管系統指標均符合猴的白晝基礎值，且各類指標基本偏向于頻率減緩(HR)、幅度降低(RH、PH、TH等)、時間延長(QRS、QT、QTc等)的基礎值下降的變化趨勢，故作者認為T波幅度與呼吸頻率降低的變化與術后恢復期間生理指標基礎值降低趨勢是一致的，并無參考意義。綜合血液學、生化學、心血管系統的指標手術前后的變化，可以認為猴手術期間無感染、炎癥等不良反應。

3.2.2考慮到猴在試驗中的依從性、體質量、年齡和猴的基礎衛生狀況等因素，圍手術期抗生素覆蓋的給藥劑量參照幼兒給藥量給予，給藥方式術前與術后使用肌注，術中應用靜脈滴注給予。

3.2.3Bertrand等曾報道過異氟烷與七氟烷的麻醉效果相同[5]，劉雪萍等也認為異氟烷是效果優秀的全身麻醉藥品[6]，且異氟烷在國內屬易于購買使用的吸入麻醉藥，故作者選擇異氟烷作為吸入麻醉藥物。為保證麻醉效果適于手術并且不會因麻醉程度過深影響手術操作，采用了戊巴比妥鈉誘導麻醉與異氟烷吸入維持麻醉結合的方法。在靜注戊巴比妥鈉時盡可能地緩慢推注并觀察猴的反應，發現猴針刺反射消失，肌肉松弛即刻停止推注，盡快完成備皮操作與手術臺固定，并更換異氟烷吸入維持麻醉，吸入麻醉的初期若出現四肢的肌肉活動，則增加異氟烷的蒸發速度，待猴進入穩定的適合手術狀態后，逐漸減少異氟烷的蒸發速度，并在整個手術過程中保持觀察猴的麻醉狀態并調節異氟烷蒸發速度。

3.2.4恒河猴皮下脂肪少，故切開皮膚時應避免用力過猛導致切到肌肉組織，考慮到術后創口愈合的速度與縫合方法的要求，作者選擇手術刀作切口，僅使用雙極電凝器止血。

3.2.5作者進行該試驗之前，進行過8例Beagle犬的植入手術，雖出現過個別犬因為抓撓傷口自拆線導致創口開裂，需要重新清創縫合、延長術后護理期的個例，但犬身體結構與活動方式與猴不同，在使用縫合方法時，一般無需考慮自拆線的可能性，皮膚縫合時應用非吸收線間段縫合法即可。并且犬皮下脂肪層較猴多，脂肪層血管分布豐富，在術中分離脂肪層易出血，術后愈合時傷口區域的脂肪組織也容易出現液化，嚴重時需要引流，并且會延長愈合時間。但猴的受術區域基本無脂肪分布，只需切開后及時止血即可；考慮到恒河猴的依從性極差，前后肢動作靈活與人相似，術后一旦恢復活動能力，猴的自發活動與猴對正常的飼養、護理等操作的應激反應，可能會出現傷口崩裂或擅自拆線行為，對傷口的恢復有一定的影響。所以作者除了選擇牢固、可吸收的縫合線之外，在縫合時適當減小針距，減少傷口崩裂的可能，并且縫合皮膚時，所有切口均用皮內連續縫合法縫合皮膚，不再暴露縫線，縫合后傷口閉合牢固，避免了猴抓撓傷口，撕拉縫線的可能性。

3.2.6因植入子本體與股動脈插管之間的壓力導管的通道是用醫用不銹鋼中空管鈍性分離建立的，該通道對應位置的水腫/血腫基本上在術后24 h左右才開始出現。其原因可能是建立通道時損傷的小血管雖然有破損，但因為手術期間猴屬固定狀態，并且麻醉時血壓偏低，術后則因為蘇醒和恢復活動需要一定時間，待猴可以自由活動后，壓力導管通道區域開始滲液/出血，導致水腫/血腫出現，但因為無感染，止血后被自體吸收即恢復正常。