密蒙花滴眼液對去勢雄兔干眼結膜炎性因子IL-1β和黏蛋白5AC及P38MAPK表達的影響

彭曉芳，彭清華，彭 俊，周亞莎，張又瑋，覃艮艷

0 引言

干眼是一種常見的眼表疾病，其病因復雜，尚無明確的病因，臨床病程發展緩慢[1]，干眼發病率極高[2]，是近年眼科的研究重點、熱點及難點。臨床實踐中，對于干眼的認識不斷深入，2017年TFOS DEWS Ⅱ對干眼的定義進行了修改，干眼的新定義為:眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩態的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經感覺異常[3]。目前干眼現有的治療方法并不理想，各類西藥均有各自的局限性，療效不滿意，甚至造成許多副作用[4-5]。

密蒙花是中國藥典收載藥品，也是眼科臨床常用中藥[6]。密蒙花有效成分為黃酮。我們基于中醫古籍理論支持以及大量臨床觀察，制備了自制藥物密蒙花滴眼液治療干眼，并進行大量實驗研究。前期臨床及實驗研究表明，密蒙花可以抑制淚腺細胞的凋亡[7-8]、顯著調節淚腺局部炎癥反應，參與抗干眼[9-10]。但密蒙花滴眼液對結膜炎性因子表達、淚膜穩定性的影響尚無研究。

故本實驗通過對雄兔行雙側睪丸、附睪切除術，成功建立干眼模型后，使用不同濃度的密蒙花滴眼液對雄兔進行治療，觀察其對去勢導致干眼雄兔結膜局部炎性因子IL-1β、黏蛋白5AC(MUC5AC)及P38MAPK表達的影響，從這些方面來評價密蒙花滴眼液對于干眼的療效，從而為中醫藥治療干眼提供現代理論依據和新的治療方法。

1 材料和方法

1.1材料選取健康成年，無全身疾患的新西蘭長耳大白兔36只，雄性，體質量1.5～2.0kg，湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，常規飼料喂養，自由進食。實驗前行常規眼科檢查(裂隙燈、眼底鏡)，排除內外疾患方進入實驗。密蒙花總黃酮和總苯丙素提取物由中南大學湘雅醫院藥劑科從密蒙花中提取；密蒙花不同濃度滴眼液由湖南中醫藥大學藥學院制備；丙酸睪酮注射液(天津金耀藥業有限公司)；注射用青霉素鈉(廣州白云山天心制藥股份有限公司)；3%H2O2去離子水(中杉金橋)；磷酸鹽緩沖液、25%烏拉坦(湖南福滋堂生物公司)；熒光素鈉眼科檢測試紙(天津晶明新技術開發有限公司)；DAB顯色劑(重慶生物技術有限公司)。本實驗得到湖南中醫藥大學動物倫理委員會審批。

1.2方法將36只健康成年雄兔按照隨機排列表法分成6組，每組6只，空白組、模型組、密蒙花滴眼液低濃度組(1mg/mL)、中濃度組(1.5mg/mL)、高濃度組(3mg/mL)、睪酮組。除了空白組外，其余組均參照馬軼群等[11]的方法，行雙側睪丸切除術(ORX)，將模型組、密蒙花滴眼液低濃度組(1mg/mL)、中濃度組(1.5mg/mL)、高濃度組(3mg/mL)、睪酮組五組實驗兔以25%烏拉坦注射液0.4mL/100mg耳緣靜脈麻醉，雄兔取仰臥位，四肢張開并固定，下腹部褪毛劑褪毛，陰囊皮下加用2%利多卡因局部麻醉，碘伏消毒，鋪無菌巾單，將一側辜丸由腹腔擠入陰囊并捏緊。用消毒刀片將陰囊切一小口，用力擠出睪丸，結扎精索靜脈及輸精管，切除睪丸及附睪，連續縫合陰囊皮膚后局部涂碘酊預防感染。另側睪丸及附睪同法切除。術中靜脈滴注生理鹽水100mL，內加青霉素40萬U，術后連續3d肌肉注射青霉素針40萬U，預防感染。造模8wk后檢查模型。各組動物均由同一人檢查，各組動物每次檢查時間、地點、照明溫度、濕度及亮度相同。模型制作成功標準：檢查干眼模型兔見角結膜外觀干燥，淚液量少，SchirmerⅠ試驗值(SⅠt)均<10mm/5min(空白組均>10mm/5min)；BUT均<10s；熒光素染色見角結膜點、片狀著色。實驗過程中，密蒙花滴眼液中濃度組及睪酮組各死亡1只。其余兔造模成功后，空白組和模型組不予以處理，密蒙花滴眼液低濃度組(1mg/mL)、中濃度組(1.5mg/mL)、高濃度組(3mg/mL)給予密蒙花不同濃度滴眼液，3次/d，睪酮組按0.5mL/kg劑量在大腿肌肉處注射丙酸睪酮，每3d 1次，用藥時間為4wk。常規喂養。各組分別于造模前及用藥4wk后，用25%烏拉坦全身麻醉后，對兔子進行SchirmerⅠ試驗、BUT及角膜熒光素染色檢測。用藥后4wk當天不予以治療，全身麻醉下以空氣栓塞法處死，即刻取出球結膜，放入多聚甲醛中固定24h，常規石蠟包埋切片，采用免疫組織化學方法嚴格按照說明書操作檢測IL-1β、MUC5AC、P38MAPK。

表1 各組兔造模前和用藥4wk后SⅠt值比較

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

2 結果

2.1各組兔造模前和用藥4wk后SⅠt值比較造模前各組SⅠt值比較差異無統計學意義(F=0.64，P>0.05)。空白組、密蒙花滴眼液中濃度組、高濃度組、睪酮組自身前后對比差異均無統計學意義(P>0.05)，密蒙花滴眼液低濃度組和模型組自身前后比較差異有統計學意義(P<0.05)。用藥4wk后,各組之間SⅠt值比較差異有統計學意義(F=37.94，P<0.01)，模型組與其余各組比較差異均有統計學意義(t模型組vs空白組=12.65，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=5.14，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=9.09，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=9.55，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=7.18，P模型組vs睪酮組<0.01)，密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組比較差異均有統計學意義(t低濃度組vs中濃度組=3.95，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=4.41，P低濃度組vs高濃度組<0.05；)，但密蒙花滴眼液中濃度組與高濃度組比較差異無統計學意義(t中濃度組vs高濃度組=0.46，P中濃度組vs高濃度組>0.05)，見表1。

表2 各組雄兔用藥4wk后角膜熒光素染色情況比較 眼

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

2.2各組兔用藥4wk后角膜熒光素染色情況比較造模前，各組大鼠角膜均透明、潤澤，熒光素染色陰性；造模成功用藥4wk后，模型組、密蒙花滴眼液各濃度組、睪酮組均有著染，其中，模型組著染最明顯。對各組大鼠角膜熒光素染色情況采用Kruskal-WallishH檢驗方法，結果顯示各組之間差異有統計學意義(χ2=45.314，P<0.01)，見表2。

2.3各組兔造模前和用藥4wk后BUT值比較造模前各組BUT值比較差異無統計學意義(F=0.60，P<0.01)，空白組、密蒙花滴眼液各濃度組及睪酮組自身前后對比差異均無統計學意義(P>0.05)，模型組自身前后比較，BUT值明顯減小，差異有統計學意義(P<0.01)。用藥4wk后，各組之間比較差異有統計學意義(F=32.91，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統計學意義(t模型組vs空白組=10.51，P模型組vs空白組<0.05；t模型組vs低濃度組=6.31，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=8.74，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=9.06，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=11.04，P模型組vs睪酮組<0.01)。密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組比較差異均有統計學意義(t低濃度組vs中濃度組=2.42，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=2.51，P低濃度組vs高濃度組<0.05)，但密蒙花滴眼液中濃度組與高濃度組比較差異有統計學意義(t中濃度組vs高濃度組=1.21，P中濃度組vs高濃度組<0.05)。密蒙花高濃度組與睪酮組比較差異有統計學意義(t高濃度組vs睪酮組=2.31，P高濃度組vs睪酮組<0.05)，見表3。

2.4免疫組織化學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，該實驗數據為定性資料，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2.4.1各組兔用藥4wk后IL-1β水平比較各組兔用藥4wk后IL-1β水平比較，差異有統計學意義(F=62.731，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統計學意義(t模型組vs空白組=16.18，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=7.64，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=10.18，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=10.27，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=12.36，P模型組vs睪酮組<0.01)；密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組、睪酮組比較，IL-1β表達增加，差異均有統計學意義(t低濃度組vs中濃度組=2.55，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=2.64，P低濃度組vs高濃度組<0.05；t低濃度組vs睪酮組=4.73，P低濃度組vs睪酮組<0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組和高濃度組比較差異無統計學意義(t=0.09，P>0.05)；密蒙花滴眼液高濃度組與睪酮組比較差異有統計學意義(t=3.09，P<0.05),見表4及圖1。

2.4.2各組兔用藥4wk后MUC5AC水平比較各組兔用藥4wk后MUC5AC水平比較差異有統計學意義(F=46.098，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統計學意義(t模型組vs空白組=14.79，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=4.93，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=8.09，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=8.45，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=9.18，P模型組vs睪酮組<0.01)；密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組、睪酮組比較，陽性表達減少，均有統計學意義(t低濃度組vs中濃度組=3.16，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=3.52，P低濃度組vs高濃度組<0.05；t低濃度組vs睪酮組=4.28，P低濃度組vs睪酮組<0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組和高濃度組、睪酮組比較差異均無統計學意義(t中濃度組vs高濃度組=0.36，P中濃度組vs高濃度組>0.05；t中濃度組vs睪酮組=1.09，P中濃度組vs睪酮組>0.05)；密蒙花滴眼液高濃度組與睪酮組比較差異無統計學意義(t=0.73，P>0.05)，見表4及圖2。

圖1用藥4wk后免疫組化觀察IL-1β的表達(×400)A：空白組結膜上皮細胞中可見極少量IL-1β陽性表達;B：模型組結膜上皮可見大量棕黃色顆粒沉著，陽性表達明顯增多;C:密蒙花滴眼液低濃度組結膜上皮細胞陽性表達較空白組增多，但較模型組少;D:密蒙花滴眼液中濃度組結膜上皮細胞可見少量IL-1β陽性表達，但較模型組明顯減少;E:密蒙花滴眼液高濃度組結膜上皮細胞中可見少量陽性表達，較模型組明顯減少;F:睪酮組結膜上皮細胞中可見少量陽性表達，較密蒙花滴眼液高濃度少。

表3 各組兔造模前和用藥4wk后BUT比較

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

表4 用藥4wk后各組兔結膜細胞中IL-1β和MUC5AC及P38MAPK平均光密度值

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

圖2用藥4wk后免疫組化觀察MUC5AC的表達(×400)A：空白組結膜上皮細胞中可見大量MUC5AC陽性表達，高于其它各組;B：模型組結膜上皮可見極少量MUC5AC，陽性表達明顯減少;C：密蒙花滴眼液低濃度組結膜上皮細胞陽性表達較空白組少，但較模型組多;D：密蒙花滴眼液中濃度組結膜上皮細胞可見較多陽性表達，較模型組明顯增多;E：密蒙花滴眼液高濃度組結膜上皮細胞中可見較多陽性表達，較模型組明顯增多;F：睪酮組結膜上皮細胞中可見大量陽性表達。

圖3用藥4wk后免疫組化觀察P38MAPK的表達(×400)A：空白組結膜上皮細胞中可見極少量P38MAPK陽性表達;B：模型組結膜上皮可見大量棕黃色顆粒沉著，陽性表達明顯增多(箭頭示);C：密蒙花滴眼液低濃度組結膜上皮細胞陽性表達較空白組增多，但較模型組少;D：密蒙花滴眼液中濃度組結膜上皮細胞可見少量陽性表達，但較模型組明顯減少;E：密蒙花滴眼液高濃度組結膜上皮細胞中可見少量陽性表達，較模型組明顯減少;F：睪酮組結膜上皮細胞中可見少量陽性表達，較高濃度少。

2.4.3各組兔用藥4wk后P38MAPK水平比較各組兔用藥4wk后P38MAPK水平比較，差異有統計學意義(F=162.058，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統計學意義(t模型組vs空白組=27.24，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=9.65，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=13.91，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=14.40，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=17.87，P模型組vs睪酮組<0.01)；密蒙花滴眼液低濃度組用藥4wk后P38MAPK水平與中濃度組、高濃度組、睪酮組比較，陽性表達增加，均有統計學意義(t低濃度組vs中濃度組=4.26，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=4.75，P低濃度組vs高濃度組<0.05；t低濃度組vs睪酮組=8.22，P低濃度組vs睪酮組<0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組和高濃度組比較差異無統計學意義(t=0.48，P>0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組與睪酮組比較差異有統計學意義(t=8.22，P<0.05)；密蒙花滴眼液高濃度組與睪酮組比較，差異有統計學意義(t=3.47，P<0.05)，見表4和圖3。

3 討論

目前干眼的病因尚未明確，干眼的致病因素多而復雜，包括有眼表炎癥、性激素失衡、神經機能障礙、維生素A缺乏和免疫功能紊等，其中，炎癥在干眼發病機制中的重要性已得到充分證明。多種炎癥因子通過交互構成的細胞因子網絡，使眼表組織炎癥反應加重。2017年TFOS DEWS Ⅱ在生物性別、社會性別及激素報告中詳細論述了性激素(如雄激素和雌激素)、下丘腦-垂體激素、胰島素、胰島素樣生長因子1、糖皮質激素和甲狀腺激素對性別相關的眼部差異的影響，其中性激素的作用尤為重要[12-13]。本實驗以此為依據，通過免疫組織化學分析發現，去勢雄兔干眼模型組結膜中可見大量炎性細胞浸潤，IL-1β有較強的陽性表達，說明干眼發病過程中結膜組織有炎癥浸潤。密蒙花滴眼液各濃度治療后，炎性細胞表達較模型組明顯減少，充分說明密蒙花滴眼液對干眼眼表炎癥有改善作用，但作用弱于雄激素。同時，密蒙花中、高濃度組對于炎癥改善作用強于低濃度組。

淚液滲透壓的升高和淚膜不穩定是干眼發生的兩大核心機制，如眼表上皮的杯狀細胞可以分泌成膠型黏蛋白，黏蛋白的作用很多，如影響細胞生長、分化、免疫、減少摩擦、潤滑眼表、減少干燥環境對黏膜上皮細胞的損害，從而對淚膜穩定性的維持具有重要作用。黏蛋白主要有7種，而黏蛋白MUC5AC是構成淚膜黏液層的最主要成分，在維持眼表穩定方面發揮著主要作用[14-15]。本實驗發現干眼病程中結膜上皮杯狀細胞分泌MUC5AC量較空白組減少，經過密蒙花滴眼液局部治療后，增加了結膜中MUC5AC的表達，同時，密蒙花中、高濃度組對于眼表MUC5AC的分泌作用高于低濃度組。

MAPK參與指導細胞對各種刺激的反應，如促細胞分裂素、滲透壓、熱休克和促炎細胞因子。它們調節細胞功能，包括增殖，基因表達、分化、有絲分裂、細胞存活和細胞凋亡[16]。本實驗對去勢后結膜中P38MAPK表達進行比較，發現去勢雄兔模型組結膜中可見大量P38MAPK陽性表達，說明P38MAPK與干眼密切相關。密蒙花滴眼液各濃度滴雙眼治療后，密蒙花滴眼液通過下調P38MAPK蛋白含量，從而下調炎癥因子的表達，其中密蒙花中、高濃度組作用強于低濃度組。我們認為密蒙花滴眼劑可能是通過干預P38MAPK通路，來阻斷相關炎癥反應，從而改善眼表癥狀，但具體的調節機制有待進一步的研究。

總之，密蒙花滴眼液可以下調去勢雄兔干眼結膜組織中IL-1β、P38MAPK的表達，增加MUC5AC的表達，從而減少干眼結膜組織的炎癥浸潤，維持淚膜穩定性，本研究表明密蒙花滴眼液對干眼有一定的療效，為干眼治療提供了新思路，有廣闊的應用前景。但具體的作用機制還有待進一步的研究。